Lavages par aspiration par coloscopie pour le profilage métataxonomique muqueux de la spondylarthrite

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7015 (2023) Citer cet article

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L'étude du microbiote gastro-intestinal des patients atteints de spondylarthrite (SpA) s'est concentrée sur l'analyse d'échantillons de matières fécales, qui représentent principalement le microbiote luminal. Le but de cette étude était de déterminer la contribution du microbiome muqueux et luminal à la dysbiose intestinale dans la SpA, en utilisant des lavages par aspiration coloscopie (CAL), une alternative récente pour les études régionales du tractus gastro-intestinal. Nous avons analysé 59 CAL (provenant du côlon sigmoïde et de l'iléon distal) et 41 échantillons de matières fécales, provenant de 32 patients atteints de SpA et de 7 individus en bonne santé, à l'aide du profilage métataxonomique ciblé sur le gène de l'ARNr 16S. Il a été trouvé une prévalence élevée de manifestations gastro-intestinales chez les patients atteints de SpA (65,3 %). Profilage métataxonomique, les échantillons CAL confirmés du tractus gastro-intestinal inférieur (côlon ou iléon) présentaient un bactériome distinctif et indifférencié et distinct de celui trouvé dans les échantillons de matières fécales ou au début du tractus gastro-intestinal (cavité buccale (OC)). Les échantillons du tractus gastro-intestinal inférieur et les matières fécales des patients atteints de SpA présentaient un comportement similaire au microbiote du groupe MII avec une richesse et une diversité microbiennes réduites, par rapport aux témoins sains. Fait intéressant, il a été constaté une augmentation des taxons pro-inflammatoires chez les patients atteints de SpA, tels que la famille des Enterobacteriaceae (principalement dans l'iléon), Succinivibrio spp. et Prevotella stercorea. À l'inverse, les patients atteints de SpA présentaient une diminution significative des producteurs d'AGCC Coprococcus catus et Eubacterium biforme. Nos données confirment la valeur des échantillons CAL pour l'étude régionale du tractus gastro-intestinal et contribuent à l'information sur les "taxons perturbateurs" potentiels impliqués dans les troubles associés au tractus gastro-intestinal observés chez les patients atteints de SpA.

Les altérations du microbiome (dysbiose) dans le tractus gastro-intestinal (GI) ont été associées à différentes pathologies avec des conséquences graves sur la santé et le bien-être. Dans certains cas, ces altérations du microbiome peuvent être générées à la suite de maladies systémiques et dégénératives telles que la SpA, un groupe de troubles rhumatismaux fortement liés aux manifestations extra-intestinales et aux symptômes gastro-intestinaux1, étant incontestable que l'incidence de la SpA augmente chez les patients présentant une inflammation intestinale subclinique2. Même les patients séronégatifs atteints de SpA présentant des symptômes gastro-intestinaux non spécifiques ont présenté des inflammations intestinales subcliniques définies par des signes iléocoloscopies3.

Il a également été rapporté une relation de causalité - associée à une prédisposition génétique - dans laquelle une dysbiose ou la simple présence de bactéries pathogènes peut déclencher une réponse immunitaire exacerbée favorisant le développement de plusieurs maladies auto-immunes telles que la maladie inflammatoire de l'intestin (MICI), une manifestation étroitement liée à la SpA4,5. De nombreuses études visaient à décrire la composition du microbiote intestinal et son rôle dans le développement et la progression de la SpA6,7, mais l'implication de la dysbiose observée dans l'intestin de ces patients n'est pas bien comprise8. Malgré la controverse, le microbiote intestinal semble être essentiel au développement de ces pathologies.

Le microbiome intestinal a une composition extrêmement variée avec une diversité bactérienne allant de 500 à 1000 espèces9. La mise en œuvre de technologies de séquençage massif basées sur la PCR (c'est-à-dire le séquençage du gène de l'ARNr 16S) a permis une compréhension plus large des communautés microbiennes et a contribué à la description du microbiome "sain" ou "malsain". Pour étudier la composition microbienne de l'intestin, il est possible d'utiliser différents types d'échantillons tels que des selles ou des biopsies du tractus gastro-intestinal (GI). Le plus fréquemment utilisé est le tabouret en raison de la facilité et de l'absence de risque lors de la collecte10, néanmoins, la composition du microbiome varie en fonction de l'emplacement dans le tractus gastro-intestinal.

Les biopsies, la microdissection par capture laser, la brosse luminale, entre autres, sont des alternatives pour l'étude régionale du tractus gastro-intestinal qui offrent la description la plus précise du microbiote10. Cependant, même si, lorsqu'une procédure invasive est requise (c.-à-d. coloscopie), une biopsie (ou microdissection par capture laser) n'est demandée qu'en cas de preuve tissulaire anormale, ce qui rend plus difficile la réalisation d'un nombre adéquat de prélèvements dans le cadre d'études de SpA. En plus de cela, les coloscopies ne sont prescrites qu'aux personnes en mauvaise santé, et compte tenu des risques et de la complexité des procédures de coloscopie, l'inscription de témoins sains complique toujours le développement d'études cliniques. Toutes ces raisons ont déplacé les études sur le microbiote intestinal vers l'utilisation des matières fécales comme proxy de la composition du microbiome intestinal, principalement comme représentation de la partie distale du tractus gastro-intestinal11. Peu d'études incluent des endroits plus proximaux comme l'intestin grêle en raison de la difficulté à atteindre cette partie, bien qu'elle soit l'une des voies les plus compromises dans le contexte de la SpA12.

Ces dernières années, des méthodes de prélèvement non conventionnelles ont été proposées, offrant des résultats similaires à ceux trouvés dans les biopsies, comme l'utilisation de résidus de CAL13. Ici, nous évaluons l'utilisation de CAL à partir du côlon sigmoïde et de l'iléon distal - la partie la plus proximale de l'intestin grêle, à partir d'iléonoscopies, et comparée à des échantillons de matières fécales, afin d'étudier le microbiome gastro-intestinal chez les patients atteints de SpA. Nos résultats métataxonomiques ont montré une composition similaire d'échantillons CAL de l'iléon et du côlon, mais des différences marquées avec les matières fécales. Quelle que soit la nature des échantillons, les patients atteints de SpA présentaient une dysbiose significative dans différentes régions du tractus gastro-intestinal, avec une augmentation marquée de l'abondance des entérobactéries, qui provenaient probablement de l'iléon.

Trente-deux patients atteints de SpA, selon la classification ASAS et les critères de l'European Spondyloarthropathy Study Group (ESSG)14,15, soignés à l'Hospital Militar Central et au Clinicos IPS de Bogotá, Colombie, ont été inclus dans une étude transversale approuvée par le comité d'éthique institutionnel. Sept volontaires sains ont été inclus comme témoins du microbiote eubiotique. De plus, trois patients diagnostiqués avec une MICI ont été inclus pour illustrer la dysbiose dans le tractus gastro-intestinal. Des témoins sains âgés de 18 à 65 ans avec des modes de vie, un statut socio-économique et des professions similaires à ceux des patients ont été inclus. Ils ont été interrogés sur la présence de symptômes gastro-intestinaux (c.-à-d. diarrhée, selles avec mucus, hématochézie, nombre quotidien de selles, douleurs et distension abdominales) et sur le régime alimentaire (tableau supplémentaire S1) ; un examen clinique a également été réalisé. Les critères d'exclusion étaient la grossesse, l'allaitement, les tumeurs malignes, d'autres maladies auto-inflammatoires ou auto-immunes, l'immunodéficience, la pancréatite chronique ou une maladie hépatique chronique et un traitement antibiotique au cours des 3 derniers mois. Aucun témoin n'a signalé de diarrhée au cours des 4 dernières semaines, 87,6 % ont signalé une défection par jour et les 14,3 % restants ont signalé deux défécations. Une distension abdominale occasionnelle a été signalée pour deux témoins, et une intolérance alimentaire mineure a été signalée chez 42,9 %, principalement due aux produits laitiers (28,6 %). Même ainsi, il n'y avait pas de mucus ou de sang dans leurs selles, et leur iléonoscopie n'a pas montré de signes d'altérations du tractus gastro-intestinal.

Un questionnaire spécifique a été appliqué demandant des symptômes gastro-intestinaux (tableau supplémentaire S1), suivi d'une évaluation clinique par un rhumatologue et chez les patients présentant ≥ 2 symptômes gastro-intestinaux, une évaluation clinique par un gastro-entérologue a également été réalisée. Après cela, il a été défini qui avait une indication d'iléocoloscopie (avec chromoendoscopie numérique avec grossissement à la Gastroadvanced Clinic de Bogota, Colombie) et d'analyse histologique. Après évaluation par le gastro-entérologue et avant l'intervention, les bénéfices et les risques de l'iléocoloscopie ont été expliqués aux patients et des consentements éclairés ont été signés. En bref, une préparation à faible volume pour la coloscopie a été réalisée avec Travad Pik (picosulfate de sodium 10 mg + oxyde de magnésium léger 3,5 g + acide citrique 12 g), pour obtenir un nettoyage adéquat de toutes les voies iléales coliques et distales, mesuré avec l'échelle de Boston (9/9)16.

Les coloscopies ont été réalisées sous sédation au propofol intraveineux assisté par un anesthésiste. Toutes les procédures ont été développées par un gastro-entérologue expert en endoscopie diagnostique et thérapeutique utilisant EVIS EXERA III CF-HQ190L/I (OLYMPUS) ou ELUXEO® 700 Series EC-760ZP-V/L (FUJI). Après irrigation avec 0,9 % de NSS (~ 250 mL), l'aspiration du côlon gauche et de l'iléon distal a été réalisée avec un circuit stérile fermé avec une pompe ERBE (EIP 2 irrigation pump flushes) et les échantillons ont été prélevés avec un piège à polypes (eTrap® BX00711099—US endoscopy) (Fig. 1A–C). Cinq millilitres d'aspirations du côlon (à gauche) et de l'iléon distal ont été recueillis dans des tubes Eppendorf séparés. Les patients et les personnes en bonne santé ont également fourni un échantillon de selles prélevé dans un récipient stérile. Les aspirations (CAL) et les selles ont été conservées à - 80 ° C avant le traitement en aval.

Résidus de lavage de coloscopie comme alternative à l'analyse du microbiome du tractus gastro-intestinal (GI). (A) Dans la coloscopie, les résidus de lavages sont collectés dans un piège à polypes. Lorsque la sonde atteint l'iléon ou le côlon, ces zones sont lavées et les résidus d'irrigation sont collectés et utilisés pour l'analyse du microbiome. L'ADN total des échantillons de lavages d'iléon et de côlon, de matières fécales et de cavité buccale (groupe externe témoin) a été extrait et analysé par NGS ciblé sur le gène 16S. (B) Grossissement des zones du côlon (à gauche) et de l'iléon (à droite) prises par coloscopie plus imagerie à bande étroite par chromoendoscopie numérique d'un patient SpA. Dans le côlon sigmoïde, des ulcères superficiels avec perte de motif vasculaire sont montrés. Dans l'iléon distal, on observe des zones d'atrophie avec perte de villosités. (C) Dissimilarité Bray-Curtis Analyse des coordonnées principales (PCoA) basée sur les caractéristiques de la communauté bactérienne. (D) et (E) Richesse de la communauté bactérienne. Variantes de séquence d'amplicon ASV, distance phylogénétique foi Faith-PD. (F) et (G) Diversité de Shannon et régularité de Pielou, respectivement. Les valeurs p significatives (en italique) pour le test de comparaisons multiples de Tukey sont indiquées.

Les échantillons de côlon et d'iléon (CAL) ont été centrifugés pendant cinq minutes à 10 000 tr/min et le culot a été utilisé pour extraire l'ADN total avec le kit de purification d'ADN PureLink™ Microbiome (Thermo Fisher Scientific Inc.). L'ADN des selles a été extrait à l'aide du kit QIAamp PowerFecal Pro DNA (QIAGEN®). L'ADN extrait a été utilisé pour préparer des bibliothèques d'amplicons de gènes d'ARNr 16S. En bref, un segment couvrant les régions variables V3 et V4 dans le gène de l'ARNr 16S a été amplifié par PCR avec l'ADN polymérase de fusion Herculase II en utilisant les amorces 341F et 805R. Ces produits ont été utilisés pour créer des bibliothèques Nextera XT Index Kit V2 et séquencés à l'aide de la plate-forme Illumina MiSeq pour obtenir des lectures appariées de 301 pb. Après séquençage, le nombre médian de lectures était de 102 226 (fourchette de 56 803 à 207 845) et a atteint la saturation dans les parcelles de raréfaction.

Pour traiter les bibliothèques générées, le pipeline Qiime 2™17 a été utilisé comme suit. Initialement, en utilisant DADA2, les 20 derniers nt de l'extrémité 3' ont été coupés en raison d'une mauvaise qualité, et les lectures ont été nettoyées, jointes, débruitées et regroupées en tant que variantes de séquence d'amplicon (ASV). Il a été trouvé 6042 caractéristiques (ASV) dans les bibliothèques avec une fréquence médiane de 41 881 (gamme 9584–68 910). Les caractéristiques ont été utilisées pour déterminer la distance phylogénétique (PD) de Shannon, Faith et Richards et les indices de régularité de Pielou, entre autres, pour évaluer la richesse, la diversité et l'abondance relative dans les groupes d'étude. D'autre part, les ASV ont été classés et attribués à des niveaux taxonomiques à l'aide de la base de données Greengenes (v. 13.5, mise à jour le 2019-05-01)18. La classification taxonomique a été validée avec la base de données SILVA 132_99 (mise à jour le 13/12/2017). Pour l'analyse bioinformatique, en raison des différences physiologiques, nous avons inclus comme groupe externe les microbiomes de la cavité buccale de ces patients. De plus, malgré le petit nombre d'échantillons, pour mettre en évidence la dysbiose, les microbiomes de patients atteints de MII, collectés à partir de CAL et de matières fécales ont été inclus pour les comparaisons. Cependant, l'analyse statistique n'a été effectuée que pour les échantillons de MII provenant de l'iléon et du côlon, où nous obtenons au moins trois échantillons.

La similarité entre les groupes a été évaluée dans QIIME2 au moyen de distances Unifrac non pondérées et d'une analyse des coordonnées principales (PCoA) avec l'indice de Bray-Curtis, avec la méthode PERMANOVA et le calcul de 1000 permutations. Les différences statistiques entre les groupes pour les indices de richesse et de diversité ont été évaluées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle ordinaire et du test de comparaisons multiples de Tukey dans la version 9 du logiciel GraphPad Prism. Dans l'analyse taxonomique d'abondance relative, des taxons présentant une abondance différentielle significative entre les groupes ont été établis dans STAMP19 à l'aide du test t non paramétrique de White. Les différences entre les moyennes des proportions moyennes > 0,2 % avec une valeur de p < 0,05 ont été considérées comme significatives.

Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de la recherche d'entreprise de l'hôpital militaire central. Tous les participants ont signé un consentement éclairé à participer et ont été informés du risque des procédures. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur.

Le groupe d'individus analysés dans cette étude était composé de 32 patients atteints de SpA et de sept individus sains. Parmi les patients atteints de SpA, 56,2 % étaient des hommes et, au moment de l'étude, 9,4 % déclaraient fumer, 28,1 % fumaient et 15,6 % se considéraient comme des fumeurs passifs. En ce qui concerne le statut matrimonial et économique, 56,3 % étaient mariés (ou vivaient avec un conjoint) et la majorité étaient des employés (34,4 %) ou avaient une pension de retraite (28,1 %). L'indice de masse corporelle (IMC) a montré que 56,3 % étaient en surpoids et 12,5 % obèses, les 31,2 % restants présentaient un IMC normal. Dans le groupe des témoins sains, 85,7 % étaient des femmes, 14,3 % fumaient, 42,9 % avaient fumé et 28,6 % étaient des fumeurs passifs. Selon l'état civil, 42,8% ont déclaré vivre avec leur conjoint, 71,4% étaient des employés, et dans ce groupe un IMC normal a été observé chez 71,4% et les 28,6% restants étaient en surpoids. En ce qui concerne les habitudes alimentaires, tous les témoins se sont déclarés omnivores, tandis que 3,1 % ont déclaré être des végétariens stricts dans le groupe SpA. De plus, dans cette analyse, trois patients atteints de MICI (sans manifestations de SpA) ont également été inclus pour représenter le microbiote dysbiotique. L'âge moyen de ces patients était de 33,2 ans (24–54), deux hommes et une femme, tous étaient des patients atteints de pancolite de type colite ulcéreuse avec la classification de Montréal pour la colite ulcéreuse E3S1. Compte tenu de la faible activité et de l'étendue de la maladie, ils étaient sous traitement pharmacologique, avec des aminosalicylates au moment des prélèvements ; le score d'activité clinique MAYO était compris entre 3 et 5 indiquant une activité clinique légère et le score endoscopique MAYO pour les 3 patients était de 1 avec une activité endoscopique légère. Aucun patient n'a présenté de complications dérivées d'une rectocolite hémorragique ou n'a nécessité une intervention chirurgicale20,21.

En nous concentrant sur les variables cliniques rhumatologiques dans le groupe SpA, nous avons constaté que 71,9 % des patients étaient diagnostiqués avec une spondylarthrite ankylosante (SA), 21,9 % avec un rhumatisme psoriasique (RP) et 6,3 % avec une arthrite réactive (ReA). Selon les critères ASAS, 9,4 % des patients présentaient une atteinte axiale, 25,0 % une atteinte périphérique et 65,6 % présentaient simultanément des symptômes axiaux et périphériques. Une infection avant le diagnostic a été signalée dans 9,4 % des cas. Concernant les symptômes musculo-squelettiques, la présence de douleurs lombaires inflammatoires a été rapportée chez 84,4%, tandis que 15,6% ont rapporté des douleurs lombaires mécaniques, 87,5% ont rapporté des enthésite et arthrite, et 18,8% des dactylites. Un traitement biologique a été rapporté chez 59,4 % des patients atteints de SpA, avec des inhibiteurs de l'IL-17 (9,4 %) et des anti-TNFα (50 %) ; les cas restants ont reçu un traitement conventionnel (40,6 %). Renforçant le rôle des manifestations du tractus gastro-intestinal dans la SpA, 65,3 % de ces patients ont signalé plus de deux symptômes gastro-intestinaux au cours du dernier mois.

En utilisant le CAL, il a été possible de collecter 29 et 30 échantillons de l'iléon et du côlon, respectivement ; De plus, 41 échantillons de matières fécales et 29 échantillons d'OC ont été inclus, le dernier comme un contrôle de l'exogroupe. Le métaprofilage du gène de l'ARNr 16S a montré, comme prévu en raison des différences physiologiques marquées, que les échantillons d'OC se regroupaient en un groupe distant du tractus gastro-intestinal inférieur et des échantillons de matières fécales dans la PCoA de Bray – Curtis (Fig. 1C). Bien que les échantillons de matières fécales et du tractus gastro-intestinal inférieur soient regroupés plus près, l'iléon et le côlon étaient impossibles à distinguer (régression linéaire multiple pour l'analyse de la variance : p = 0,5691, R carré = 0,8609), tandis que le groupe des matières fécales était légèrement décalé vers l'un des axes et différent de l'iléon et du côlon (valeurs p : 0,0051 et 0,0114, respectivement). Étant donné que les selles entraînent des microbes répartis dans tout le tractus gastro-intestinal, cela peut expliquer les différences de matières fécales. Par conséquent, les échantillons de matières fécales ont révélé une richesse en espèces significativement plus élevée, avec une moyenne de 212 ± 73 #ASV, contre 142 ± 73 et 140 ± 69, pour le côlon et l'iléon, respectivement (Fig. 1D). La distance phylogénétique de foi (indice de richesse basé sur la taille de l'arbre phylogénétique) a confirmé une communauté bactérienne fécale significativement plus riche, avec 18,9 ± 5,4 pour les fèces, contre 10,6 ± 4,4 et 12,9 ± 4,3 (substitutions / site), pour le côlon et l'iléon, respectivement (Fig. 1E). Malgré une plus grande richesse en ASV (Fig. 1D), le bactériome OC était significativement moins diversifié, comparé au côlon et à l'iléon (indice de Shannon : 4,9 ± 0,87, 4,8 ± 0,97 et 4,1 ± 1,1, pour le côlon, l'iléon et l'OC, respectivement) (Fig. 1F). En conséquence, les échantillons de matières fécales étaient les plus diversifiés (indice de Shannon : 5,9 ± 0,87). Conformément à cela, le groupe de matières fécales était le plus uniforme (uniformité relative des espèces), et encore une fois, les échantillons du tractus gastro-intestinal inférieur présentaient une distribution d'uniformité intermédiaire (Fig. 1G). En conclusion, les échantillons CAL du tractus gastro-intestinal inférieur (côlon ou iléon) présentaient un bactériome distinctif et indifférencié et distinct de celui trouvé dans les échantillons de matières fécales ou au début du tractus gastro-intestinal tel que l'OC.

Les caractéristiques identifiées ont été évaluées pour la classification taxonomique, trouvant une signature de composition claire pour les échantillons de muqueuse du tractus gastro-intestinal inférieur (côlon et iléon), composés principalement de Bacteroides, Faecalibacterium, Prevotella, Eubacterium, Dorea et Clostridium genre (Fig. 2A). Bien que Bacteroides et Faecalibacterium soient également abondants dans les fèces, Prevotella a montré une augmentation marquée dans ce groupe et, en général, le bactériome prédominant (conformé par les taxons avec une fréquence relative> 0,5%) était plus gros, comprenant 22 genres, contre 16 et 17 pour le côlon et l'iléon, respectivement. Au niveau de la famille, Ruminococcaceae, Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Enterobacteriaceae, Prevotellaceae, Fusobacteriaceae, Erysipelotrichaceae étaient présentes dans le bactériome prédominant du tractus gastro-intestinal inférieur. À ce niveau taxonomique, les échantillons de matières fécales ont montré dans leur bactériome prédominant : Succinivibrionaceae, Verrucomicrobiaceae et Bifidobacteriaceae, entre autres, qui sont probablement transportés depuis des endroits éloignés du tractus gastro-intestinal inférieur, ou différents de la muqueuse (bactéries circulantes luminales), car ils n'ont pas été détectés comme prédominants dans les CAL du côlon ou de l'iléon (Fig. 2B). La classification par ordre a montré que Clostridiales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Fusobacteriales, Erysipelotrichales prédominaient dans le tractus gastro-intestinal distant (Fig. 2C). En général, la plus grande diversité et richesse observée dans les échantillons de matières fécales peut s'expliquer par une augmentation des familles et des genres de taxons, mais pas dans l'ordre et la classe où le nombre de taxons identifiés comme prédominants dans les trois groupes était similaire (Fig. 2C, D).

Analyse taxonomique d'échantillons de côlon, d'iléon et de matières fécales. Le côlon et l'iléon présentent une composition bactérienne plus proche. Les barres représentent la fréquence relative moyenne à différents niveaux taxonomiques pour chaque groupe. Les niveaux de genre (A), de famille (B), d'ordre (C) et de classe (D) sont indiqués. Les taxons dont la fréquence relative est supérieure à 0,5 % sont indiqués. Les taxons les plus abondants sont décrits à droite de chaque barre, en commençant par le haut avec les caractéristiques les plus abondantes.

L'analyse de l'abondance différentielle (utilisant les différences entre les moyennes, DBM), n'a pas montré de différences statistiquement significatives entre les bactériomes muqueux du côlon et de l'iléon, lors de la comparaison aux niveaux de l'espèce, du genre, de la famille, de la classe et du phylum. Cependant, l'ordre des Burkholderiales était plus abondant dans le côlon (proportion moyenne pour l'iléon et le côlon, respectivement : 0,82 ± 1,07 % et 1,54 ± 1,52 %, p = 0,0499). Ces résultats confirment le bactériome indiscernable identifié dans le côlon ou l'iléon au moyen d'échantillons CAL. Cependant, en comparaison avec les matières fécales, les échantillons du tractus gastro-intestinal inférieur ont montré un enrichissement en Dorea formicigenerans, Haemophilus parainfluenzae (significatif uniquement pour l'iléon), Clostridium paraputrificum et Methylobacterium mesophilicum (Fig. 3A). Les échantillons de côlon et d'iléon ont montré un enrichissement significatif des genres Bacteroides et Faecalibacterium ; familles Enterobacteriaceae et Bacteroidaceae (Fig. 3C); et l'ordre des Enterobacteriales (Fig. 3D). D'autre part, l'analyse de l'abondance différentielle a confirmé l'enrichissement et la plus grande diversité trouvée dans les matières fécales (Fig. 3A – D), qui est principalement due aux Bacteroidales (ordre), et parmi celles-ci, les Prevotellaceae (famille) et le genre Prevotella, en particulier Prevotella copri. En résumé, les échantillons CAL du tractus gastro-intestinal inférieur sont utiles pour l'étude des bactéries muqueuses au moyen de stratégies ciblées sur le gène ARNr 16S, avec l'épuisement d'un nombre important de micro-organismes qui semblent être entraînés de manière non spécifique par les matières fécales, de n'importe où dans le système digestif.

Le côlon et l'iléon présentent une composition bactérienne caractéristique avec certains taxons surreprésentés dans ces régions du tractus gastro-intestinal. La différence entre l'abondance relative moyenne (DBM, axe des x supérieur), pour le côlon (vert) ou l'iléon (rouge) par rapport aux matières fécales est représentée sous forme de barres. Les valeurs positives indiquent les taxons surreprésentés dans le côlon ou l'iléon, et les valeurs négatives indiquent ceux surreprésentés dans les matières fécales. Les astérisques correspondent aux valeurs de p (axe des x inférieur) pour le test t non paramétrique de White. Les taxons présentant une DBM > 0,2 % et une valeur de p < 0,05 pour au moins une comparaison appariée (iléon ou côlon vs fèces) ont été inclus dans les parcelles. (A) Classement des espèces. (B) Genre. (C) Famille. (D) Ordre, classe et embranchement.

Des bibliothèques de séquençage ciblé du gène de l'ARNr 16S à partir d'échantillons de matières fécales et de CAL ont été utilisées pour établir toute différence possible entre le bactériome des patients atteints de SpA et des individus en bonne santé. Le microbiote des échantillons de matières fécales de patients atteints de SpA n'a pas montré de différences significatives dans le nombre d'ASV (252 ± 45 et 208 ± 73, SpA vs sain, respectivement) et Faith-PD (20, 1 ± 4, 1 et 19, 0 ± 5, 4, SpA vs sain, respectivement) indices de richesse, par rapport à ceux identifiés dans le groupe sain (Fig. 4A). De plus, la distribution uniforme de Pielou de la population de bactéries n'a pas montré de différences significatives entre la santé et la SpA. Néanmoins, la diversité de Shannon évaluée dans ce type d'échantillons était significativement plus faible chez les patients atteints de SpA, avec une moyenne de 5,9 ± 0,43 contre 6,4 ± 0,52 pour les individus sains (p = 0,0400).

Les individus en bonne santé présentaient la richesse et la diversité bactériennes les plus élevées dans différentes zones du tractus gastro-intestinal. La richesse (variantes de séquence d'amplicon, ASV), la diversité de Shannon, la diversité phylogénétique de Faith (PD) et la régularité de Pielou sont indiquées pour les échantillons de fèces (A), de côlon (B) et d'iléon (C). Les valeurs p significatives (en italique gras) pour le test de comparaisons multiples de Tukey sont indiquées. SpA spondylarthrite, maladie intestinale inflammatoire de l'IBD. Pour les échantillons de MII, l'analyse statistique n'a été effectuée que pour l'iléon et le côlon, où nous obtenons au moins trois échantillons. Ce groupe a été inclus pour illustrer la dysbiose intestinale.

Le microbiote résidant dans le côlon a montré une diminution significative des indices de richesse pour les patients atteints de SpA, pour le nombre moyen d'ASV (217 ± 26 contre 132 ± 72, sains et SpA, respectivement) et Faith-PD (15,6 ± 2,5 contre 10,0 ± 4,1) (Fig. 4B). Comme prévu pour les patients atteints de MICI, ce groupe a montré une diminution significative de la richesse par rapport aux individus sains, mais aucune différence vis-à-vis de la SpA. La diversité de Shannon était plus faible pour les patients atteints de SpA et de MII dans cette localisation du tractus gastro-intestinal, cependant, les différences n'étaient pas significatives, bien qu'une tendance possible à la diminution ne puisse être exclue en raison des faibles valeurs de p (< 0,1). Des résultats similaires ont été trouvés dans l'iléon; encore une fois, la richesse de la bactérie et la diversité de Shannon étaient plus faibles pour les patients SpA (non significatifs mais avec de faibles valeurs de p) et les patients atteints de MICI, par rapport aux individus en bonne santé (Fig. 4C). Ces résultats pourraient s'expliquer par une insuffisance de la puissance statistique due à la perte d'un échantillon d'iléon dans le groupe sain.

En utilisant le DBM des abondances relatives (pourcentage dans le groupe sain moins SpA), nous avons déterminé les taxons montrant toute disparité entre les groupes (Fig. 5). L'ordre des entérobactéries, en particulier la famille des entérobactéries, a montré un enrichissement constant chez les patients atteints de SpA (Fig. 5C, D), à la fois dans les localisations du tractus gastro-intestinal bas et dans les fèces. Bien qu'il y ait eu une augmentation de l'abondance d'environ sept points de pourcentage pour ces taxons dans les échantillons de côlon (plus importante que celle observée dans les matières fécales), elle n'était pas significative (points verts). Il est à noter que la plus forte augmentation significative de ces taxons a été observée chez les patients atteints de SpA iléale (− 11,2 %, p = 0,0128). Au total, ces résultats suggèrent que l'augmentation apparente observée dans les matières fécales est probablement due à un enrichissement de la famille des entérobactéries dans le tractus gastro-intestinal inférieur des patients atteints de SpA, principalement dans l'iléon.

Différences entre les abondances relatives moyennes (DBM) (axe des ordonnées) pour le groupe témoin (individus en bonne santé) par rapport aux patients atteints de SpA, pour les échantillons de fèces (orange), d'iléon (rouge) et de côlon (vert). Les valeurs DBM positives indiquent les taxons surreprésentés chez les individus sains, et les valeurs négatives indiquent ceux surreprésentés chez les patients atteints de SpA tels que Prevotella stercorea dans le côlon (A). Sur l'axe des abscisses, les valeurs de p pour les comparaisons appariées du test t non paramétrique de White (sain contre SpA) sont tracées. Les seuils arbitraires DBM (± 0, 2%) et le seuil significatif de valeur p (0, 05) sont indiqués respectivement par des lignes horizontales et verticales bleues en pointillés. Les taxons présentant une abondance différentielle significative pour les classifications d'espèce (A), de genre (B), de famille (C) et d'ordre (D) sont présentés.

Les individus en bonne santé ont montré un enrichissement de certains taxons spécifiques dans les échantillons de matières fécales, tels que Erysipelotrichales (ordre), Erysipelotrichaceae (famille), Eubacterium (genre) et Eubacterium biforme (Fig. 5A – D), qui n'ont pas été modifiés dans le côlon ni l'iléon, bien qu'ils fassent partie du microbiome abondant à ces endroits (voir Fig. 2). De même, Aeromonadales (ordre), Succinivibrionaceae (famille) et Succinivibrio (genre), ont été enrichis chez les patients SpA, spécifiquement dans les fèces, mais pas dans le côlon ou l'iléon, cependant ces taxons n'ont pas été trouvés en abondance dans ces autres endroits. En prenant ensemble ces résultats, il est suggéré que ces altérations spécifiques aux matières fécales sont probablement provoquées par des bactéries résidant dans d'autres endroits que le côlon sigmoïde ou l'iléon distal. De plus, certains autres taxons tels que Coprococcus (en particulier C. catus) et Prevotella stercorea (uniquement dans les échantillons de côlon) présentaient respectivement une réduction et un enrichissement chez les patients atteints de SpA, avec des altérations légères mais significatives (Fig. 5A, B), qui n'étaient perceptibles que dans les échantillons CAL du côlon ou de l'iléon. Ces taxons appartiennent au bactériome abondant dans les échantillons de matières fécales, ce qui entrave probablement ces changements subtils spécifiques à la zone observés dans le côlon et/ou l'iléon. En conclusion, nos résultats montrent que, bien que la dysbiose associée à la SpA puisse être déterminée dans n'importe quel type d'échantillons, l'utilisation de la CAL a permis de contribuer à la mise en évidence d'altérations locales des taxons bactériens chez les patients atteints de SpA.

L'utilisation de méthodes alternatives d'échantillonnage intestinal devient attrayante pour l'analyse plus approfondie des compositions bactériennes spécifiques à la région. Il a été rapporté que la source de nutriments et l'interaction avec l'hôte affectent la composition du bactériome dans le tractus gastro-intestinal, augmentant l'abondance et la diversité avec la progression vers l'intestin distal22. C'est pourquoi l'utilisation de méthodes d'échantillonnage spécifiques à la zone est importante pour la compréhension de la dynamique entre l'hôte et les bactéries résidentes qui favorisent la pathogenèse. Bien que les biopsies aient été reconnues comme l'étalon-or pour les études régionales du tractus gastro-intestinal muqueux, certaines limitations telles que le faible rendement en ADN (dans certains cas inadéquat pour les études NGS), la contamination élevée de l'ADN de l'hôte, le risque de saignement et d'infection lors de la collecte et l'inadéquation pour les individus en bonne santé, augmentent la difficulté des études régionales du tractus gastro-intestinal. C'est pourquoi, nous évaluons ici l'utilisation de la CAL pour l'étude des altérations du tractus gastro-intestinal muqueux chez les patients atteints de SpA. Il a été rapporté que la CAL génère des rendements d'ADN bactérien plus élevés, est applicable aux témoins sains et offre des différences minimes par rapport aux biopsies13,23. Nos résultats contribuent à la connaissance du bactériome muqueux du tractus gastro-intestinal spécifique à la région, car à ce jour (révisé le : 03-11-2023), peu d'études se sont concentrées sur l'utilisation d'échantillons muqueux plutôt que fécaux13,23,24,25,26,27,28, et aucune d'entre elles dans le contexte des altérations du tractus gastro-intestinal associées à la SpA.

Nos résultats de richesse, diversité et dissemblance (PCoA) ont démontré que les échantillons CAL du côlon ou de l'iléon présentaient un bactériome unique et indiscernable, et différent de celui trouvé dans les échantillons de matières fécales ou dans le CO. Ces résultats ont mis en évidence deux conclusions importantes : premièrement, la collecte de CAL est une bonne méthode d'échantillonnage pour l'étude du microbiome muqueux (celui représenté par les biopsies, la microdissection par capture laser ou CAL), car de fortes différences ont été observées lors de la comparaison avec des échantillons de matières fécales qui font une meilleure représentation du bactériome intestinal luminal ; Deuxièmement, les échantillons CAL ne sont pas les plus appropriés pour l'identification des changements au cours de la progression du tractus gastro-intestinal, en raison de variations minimes observées lors de la comparaison des groupes côlon et iléon (aucune différence de richesse et de diversité et seul l'ordre Burkholderiales a montré un enrichissement dans le côlon). L'imprécision du bactériome du tractus gastro-intestinal inférieur (iléon distal par rapport au côlon sigmoïde) et la différence avec le bactériome fécal ont déjà été démontrées pour les biopsies (considérées comme l'étalon-or)24,29. Vaga, et al. la richesse et la diversité des espèces de métagénomes trouvées n'ont pas montré de différences significatives à plusieurs endroits du tractus gastro-intestinal muqueux (iléon terminal, côlon transverse et rectum) au moyen de biopsies ; et de manière similaire, Zoetendal et al. n'ont pas trouvé de différences dans l'indice de similarité en utilisant des échantillons de biopsie muqueuse distribués le long du côlon30. Une explication raisonnable de ces résultats à l'aide de CAL ou de biopsies est que les changements dans la composition du microbiote muqueux à différents endroits peuvent être entravés par la contamination du liquide luminal GI à travers le canal endoscopique10. Comme preuve, les données montrent que les groupes bactériens les plus prédominants dans l'iléon étaient les anaérobies. Il est bien connu que la plupart de la population bactérienne prédominante de l'iléon sont des anaérobies facultatifs, avec une petite proportion d'anaérobies31. Néanmoins, pour essayer de réduire la contamination, le caecum a été lavé avec du NSS (100 ml) et après aspiration du contenu, le canal a été lavé à nouveau avec du NSS (50 ml) avant de canuler l'iléon distal ; une fois à l'intérieur de l'iléon distal, une première aspiration de tout le contenu a été effectuée, qui a été jetée et l'irrigation a été effectuée à nouveau avec NSS (~ 250 ml) et le contenu a été aspiré avec un circuit fermé stérile, et les échantillons ont été prélevés avec un piège à polypes.

Néanmoins, nos échantillons CAL ont représenté avec succès le bactériome muqueux, qui est particulièrement important en raison de son interaction directe connue avec les cellules épithéliales et immunitaires23. En effet, les patients atteints de SpA ont montré une diminution de la richesse bactérienne, et cela était plus évident au niveau du bactériome muqueux (iléon et côlon). D'autres études ont mis en évidence des différences plus notables lors de l'utilisation de surfaces muqueuses au lieu d'échantillons fécaux27. Malheureusement, le recrutement d'individus en bonne santé consentant à la collecte d'échantillons de coloscopies (CAL) a été difficile, réduisant notre groupe de contrôle, ce qui a eu un impact sur la puissance statistique de la diversité bactérienne (indice de Shannon), même si les patients atteints de SpA ont montré une tendance à la diminution de la diversité (p < 0,1).

La perte de richesse et de diversité a été expliquée par l'enrichissement et l'épuisement de certains taxons chez les patients atteints de SpA, soulignant leur potentiel en tant que candidats pour de futures études. Parmi eux, la famille des entérobactéries a montré un enrichissement constant chez les patients atteints de SpA, à la fois dans les localisations du tractus gastro-intestinal bas et dans les fèces. L'augmentation significative la plus élevée pour ce taxon a été observée dans l'iléon chez les patients atteints de SpA, ce qui suggère que l'augmentation des matières fécales est probablement due à l'enrichissement du tractus gastro-intestinal inférieur, principalement dans l'iléon, où se produit la majeure partie de l'inflammation intestinale dans la SpA axiale et périphérique32. La famille des entérobactéries a été précédemment rapportée comme étant enrichie dans le microbiote fécal de la spondylarthrite ankylosante, le diagnostic le plus représentatif chez les patients atteints de SpA33. De plus, certains genres d'Enterobacteriaceae tels que Yersinia spp., Salmonella spp. et Shigella spp. ont été associés à l'arthrite réactive34. Il convient de noter que les entérobactéries ont été montrées comme un membre décisif des consortiums microbiens, capables d'interagir avec la communauté microbienne endogène pour induire la colite héréditaire maternelle et les MICI35, et la prévention de la croissance des entérobactéries a diminué les dommages SI dans les modèles de colite murine36. Il serait intéressant d'étudier plus avant les entérobactéries pour déterminer les membres de cette famille pertinents pour l'interaction avec le système immunitaire chez nos patients, car il a été prouvé qu'un large éventail de bactéries appartenant à cette famille est capable de stimuler les cellules mémoires réactives Th1/17, connues pour leur activité pro-inflammatoire (sécrétion d'IFN-γ, IL-17A et IL-22)37, et qui pourraient être liées à des manifestations gastro-intestinales ou systémiques chez les patients atteints de SpA. Malheureusement, le pouvoir de résolution de la technologie de séquençage utilisée dans cette étude n'a pas permis de classer les membres enrichis en SpA de cette famille.

Curieusement, nous avons trouvé une augmentation forte et significative des Succinivibrionaceae (et Succinivibrio spp), en parallèle avec un schéma d'enrichissement non significatif en Akkermancia muciniphila et Bacteroides fragilis, dans les échantillons de fèces des patients atteints de SpA (Fig. 5). Tous ces taxons ont été signalés comme producteurs de succinate38. Remarquablement, les MII, la colite et d'autres pathologies associées à la dysbiose du microbiote intestinal ont été liées à l'accumulation de succinate dans la lumière intestinale, qui peut être due à une augmentation des producteurs de succinate et/ou à une diminution des consommateurs de succinate39,40. De plus, Saraiva et al. en utilisant des souris déficientes pour le récepteur de succinate Sucnr1/GPR91, atténuait le développement de l'arthrite et réduisait le trafic et l'expansion des cellules Th17 vers les ganglions lymphatiques, et inversement, la complémentation du succinate augmentait le recrutement et le trafic de Th17 et la gravité de l'arthrite41. Ces découvertes, ainsi que nos résultats sur l'enrichissement des bactéries productrices de succinate dans la lumière des patients atteints de SpA, suggèrent qu'ils pourraient être traités avec des thérapies ciblant l'inflammation du succinate, telles que le clématichinenoside AR (C-AR), une médecine traditionnelle chinoise naturelle42, ou toute stratégie diététique qui réduit le succinate circulant. Un autre taxon impliqué dans la production de succinate est Prevotella spp. qui exacerbe l'inflammation intestinale des muqueuses, augmente le succinate et réduit les acides gras à chaîne courte (SCFA) dans le tractus gastro-intestinal43. Fait intéressant, nous avons trouvé un enrichissement significatif de Prevotella stercorea dans le côlon sigmoïde des patients colombiens atteints de SpA.

Contrairement à l'augmentation des producteurs de succinate, nous avons constaté une diminution significative des taxons sains, tels que Coprococcus catus et Eubacterium biforme dans le microbiote muqueux (côlon et iléon) et luminal (fèces) des patients atteints de SpA, respectivement. Les deux taxons sont largement connus pour leur capacité à produire des métabolites bénéfiques et à faire partie du microbiome intestinal sain44,45. Ils produisent du butyrate et Coprococcus catus produit également du propionate (SCFA)46. Dans des modèles animaux, il a été démontré que le propionate supplémenté dans l'alimentation (et certains SCFA) réduit la gravité de l'arthrite et l'inflammation des articulations47, et restaure un microbiote intestinal sain48. Conformément à cela, la supplémentation en butyrate a également altéré le développement de l'arthrite en favorisant la production du métabolite 5-HIAA (acide 5-hydroxyindole-3-acétique), par des acteurs secondaires du microbiome intestinal, et en stimulant un état de régulation immunitaire (augmentation des cellules Breg)49.

En conclusion, le profilage métataxonomique a confirmé que les échantillons de CAL du tractus gastro-intestinal inférieur (côlon sigmoïde ou iléon distal), dans la SpA, présentaient un bactériome distinctif avec un comportement similaire au groupe IBD, avec une richesse et une diversité microbienne réduites, par rapport aux témoins sains. En ce sens, la remise à neuf d'un microbiote sain et/ou le contrôle de la circulation des métabolites dans le tractus gastro-intestinal pourraient être une stratégie de traitement des patients atteints de SpA, qui pourrait compléter les traitements conventionnels ou biologiques pour améliorer les symptômes ou améliorer les résultats. Cet élément de preuve de la dysbiose des patients atteints de SpA confirme l'importance de l'exploration de stratégies non conventionnelles, telles que les régimes riches en fibres (qui augmentent les SCFA), la supplémentation en métabolites ou le développement de métabolites ou de leurs récepteurs. thérapies ciblant. Ici, en utilisant le profilage du microbiote spécifique à la région, nous apportons des informations sur les "taxons perturbateurs" potentiels impliqués dans les troubles associés au tractus gastro-intestinal observés chez les patients atteints de SpA, qui pourraient aborder le développement de ces nouvelles stratégies.

Les manifestations gastro-intestinales sont très fréquentes chez les patients atteints de SpA. L'interaction entre le microbiote intestinal et le système immunitaire peut expliquer ces manifestations systémiques et locales. Les études métataxonomiques actuelles pour cette maladie (et la plupart des études sur le tractus gastro-intestinal) se sont concentrées sur l'analyse du microbiome luminal, en utilisant des échantillons de matières fécales, mais des interactions de signaux se produisent dans la muqueuse. Ici, nous mettons en œuvre des échantillons de CAL pour représenter le tractus gastro-intestinal muqueux et les comparer au microbiote luminal. À notre connaissance, il s'agit de la première étude des communautés microbiennes chez les patients atteints de SpA utilisant des lavages d'aspiration coloscopie. Notre stratégie a permis l'inclusion d'individus sains, non appropriés lors de l'utilisation de biopsies. Nous avons généré des preuves importantes de la dysbiose luminale et muqueuse de la SpA et identifié certains « taxons perturbateurs » précédemment signalés comme étant impliqués dans l'activation des états inflammatoires, et associés à l'enrichissement et à l'épuisement de certains métabolites importants, qui pourraient aborder le développement ou la mise en œuvre de nouvelles stratégies pour le traitement de la SpA. Cependant, pour renforcer ces conclusions, les études futures devraient aborder certaines limites de nos résultats, telles que le petit nombre de témoins sains et d'échantillons dysbiotiques de MICI.

Les ensembles de données générés pour cette étude (lectures brutes) se trouvent dans le NCBI BioProject PRJNA847196 et dans le tableau S1.

Spondylarthrite

Maladie inflammatoire de l'intestin

Tube digestif

Colonoscopy aspiration lavages

Cavité buccale

Foi distance phylogénétique

Analyse des coordonnées principales

Différences entre les moyennes

Acides gras à chaîne courte

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Nous remercions les institutions, le personnel de laboratoire et les chercheurs de l'Universidad El Bosque, de l'Hospital Militar Central, des Clinicos IPS et de la Fundación Instituto de Rheumatología Fernando Chalem.

Cette étude a été soutenue par le ministère des Sciences, de la Technologie et de l'Innovation (subvention n° 130877757442), l'Université El Bosque, l'hôpital Militar Central (2017-023 et 2019-032), les cliniques IPS, Gastroadvanced, la Fondation Fernando Chalem de rhumatologie, l'investigation et la biomédecine de Chihuahua et l'Association colombienne de rhumatologie (subvention 2019). Le financement des frais de publication a été fourni par l'Association colombienne de rhumatologie et l'Université El Bosque.

Laboratoire de Génétique Moléculaire Bactérienne/LGMB, Vice-Recteur pour la Recherche, Universidad El Bosque, Av. Cra 9 No. 131 A–02, Bogotá, Colombie

Ricaurte A. Marquez-Ortiz, Deisy Abril & Javier Escobar-Perez

Programme de maîtrise en sciences biomédicales fondamentales, Faculté des sciences, Universidad El Bosque, Bogotá, Colombie

Moïse Léon

Groupe d'immunologie cellulaire et moléculaire/INMUBO, École de médecine dentaire, Université El Bosque, Av. Cra 9 Non. 131 A–02, Bogota, Colombie

Cristian Florez-Sarmiento, Viviana Parra-Izquierdo & Consuelo Romero-Sanchez

Gastroadvanced, Bogotá, Colombie

Cristian Florez-Sarmiento & Viviana Parra-Izquierdo

Fondation de l'Institut Fernando Chalem de rhumatologie, Bogotá, Colombie

Philippe Chalem

Hospital Militar Central, Département de rhumatologie et d'immunologie, Bogotá, Colombie

Consuelo Romero Sanchez

Groupe d'immunologie clinique, École de médecine, Université militaire de Nueva Granada, Bogotá, Colombie

Consuelo Romero Sanchez

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RAM-O. : conceptualisation, acquisition de financement, curation des données, analyse formelle, méthodologie, validation, rédaction-ébauche originale, rédaction-révision et édition ; ML : méthodologie et rédaction-revue ; DA : curation des données, méthodologie et rédaction-revue ; JEP : conceptualisation, acquisition de financement et rédaction-révision ; CF-S. : curation des données, analyse formelle, méthodologie et rédaction-revue ; VPI : curation des données, analyse formelle, méthodologie et rédaction-revue. PC : conceptualisation, acquisition de financement, conservation des données, analyse formelle, méthodologie et rédaction-révision. CR-S. : conceptualisation, acquisition de financement, conservation des données, analyse formelle, méthodologie et rédaction-révision et édition.

Correspondance à Ricaurte A. Marquez-Ortiz ou Consuelo Romero-Sanchez.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Marquez-Ortiz, RA, Leon, M., Abril, D. et al. Lavages par aspiration par coloscopie pour le profilage métataxonomique muqueux des altérations du tractus gastro-intestinal associées à la spondylarthrite. Sci Rep 13, 7015 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33597-y

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Reçu : 05 juillet 2022

Accepté : 15 avril 2023

Publié: 28 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-33597-y

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