Les agonistes de TLR5 renforcent l'anti

Communications Biology volume 6, Article number: 31 (2023) Citer cet article

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La résistance primaire et adaptative aux thérapies de point de contrôle immunitaire (ICT) représente un obstacle considérable à l'amélioration de la survie globale. Les activateurs immunitaires innés ont été activement recherchés pour leur potentiel antitumoral. Nous rapportons ici qu'un modèle murin de carcinome mammaire syngénique 4T1 pour un cancer du sein triple négatif hautement réfractaire établi a montré une survie améliorée lorsqu'il est traité par voie intra-tumorale avec la flagelline agoniste TLR5 ou CBLB502, un dérivé de la flagelline, en combinaison avec des anticorps ciblant CTLA-4 et PD-1. Les souris survivantes à long terme ont montré une mémoire immunologique lors d'une nouvelle provocation tumorale et un profil distinctif de cytokines activatrices immunitaires qui engageaient à la fois l'immunité innée et adaptative. De faibles taux sériques de G-CSF et de CXCL5 (ainsi qu'un taux élevé d'IL-15) étaient des biomarqueurs prédictifs candidats corrélés à une survie améliorée. L'amélioration de l'ICT induite par CBLB502 a également été observée dans les tumeurs de mélanome B16-F10 faiblement immunogènes. La thérapie par point de contrôle immunitaire combinée aux agonistes du TLR5 pourrait offrir une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter les tumeurs solides réfractaires aux TIC.

Les thérapies par points de contrôle immunitaire (TIC) ont ouvert de nouvelles voies thérapeutiques contre le cancer avec des effets curatifs durables1,2. Deux régulateurs de point de contrôle immunitaire bien caractérisés ciblés dans les TIC sont PD-1 et CTLA-43,4. PD-1 module l'activité immunitaire en inhibant l'apoptose des T-regs immunosuppresseurs et en favorisant l'apoptose des lymphocytes T spécifiques de l'antigène5. PD-1 est également connu pour inhiber l'activation des cellules B6. En revanche, on pense que CTLA-4 interfère avec l'activation des lymphocytes T4,5. Cependant, la majorité des patients atteints de cancer ne répondent pas à ces traitements ou rechutent après une période de réponse7. Un thème commun qui prévaut dans les mécanismes de résistance est l'incapacité à susciter une réponse adaptative durable en raison de déficiences dans l'une quelconque d'un certain nombre d'étapes du processus de présentation de l'antigène tumoral. On pense que ces déficiences sont probablement causées par une faible expression de protéine antigénique inhérente ou acquise et/ou un découplage de la signalisation de présentation de l'antigène dans les cellules tumorales ou le microenvironnement tumoral et l'activation immunitaire. Indépendamment des mécanismes de résistance, il est possible que l'activation directe de l'immunité innée déclenche une réponse immunitaire capable de surmonter la résistance tumorale aux thérapies basées sur les points de contrôle immunitaire8.

Des preuves récentes indiquent que les thérapies qui exploitent l'immunité innée présentent un potentiel antitumoral prometteur9. Dans plusieurs études, Salmonella typhimurium, une bactérie intracellulaire facultative flagellée, induit une régression tumorale dans des modèles précliniques10,11,12,13,14,15,16,17. S'appuyant sur ce concept, des essais thérapeutiques avec des espèces de Salmonella sont en cours (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT03762291). Les effets thérapeutiques de Salmonella sont probablement dus à l'antigénicité des bactéries et à l'activation de la reconnaissance à médiation immunitaire de l'hôte des modèles moléculaires associés aux agents pathogènes par les récepteurs de type Toll (TLR)14,18,19,20. Sans surprise, il a été démontré que de nombreux agonistes des TLR provoquent une activité antitumorale21,22,23,24. En particulier, le traitement avec la flagelline bactérienne, un agoniste du TLR525, entraîne de puissantes réponses antitumorales dans divers modèles de xénogreffes pour le cancer du côlon, du sein et de la prostate, ainsi que dans un certain nombre de modèles de tumeurs spontanées chez la souris23,26,27,28,29,30,31. Fait intéressant, des niveaux d'expression plus élevés de Tlr5 sont corrélés à une meilleure survie chez les patientes atteintes d'un cancer du sein, du poumon et de l'ovaire32. Bien que les mécanismes précis des effets antitumoraux médiés par le TLR5 restent à élucider, on sait que le TLR5 médie les réponses immunitaires innées contre la flagelline bactérienne25, probablement par l'activation de voies pro-inflammatoires, y compris NF-κB26,32,33. Il est intéressant de noter que TLR5 peut également médier l'activation immunitaire adaptative en agissant comme un récepteur co-stimulateur sur les lymphocytes T CD4 + d'une manière analogue au rôle co-stimulateur de CD28 lors de l'activation des lymphocytes T CD4 + naïfs34. Ainsi, il est possible que les réponses antitumorales soient un effet collatéral de la réponse immunitaire de l'hôte à la flagelline. La réponse immunogène médiée par le TLR5 a conduit à l'exploration de réactifs dérivés de la flagelline adaptés à une application clinique. CBLB502 (Entolimod) est un fragment de protéine flagelline recombinante dérivé de Salmonella enterica, qui agit comme un agoniste du TLR5 et un activateur de la réponse inflammatoire NF-κB35,36. Dans un certain nombre d'études précliniques, le traitement avec CBLB502 a montré des effets antitumoraux et anti-métastatiques par l'activation de composants du système immunitaire inné37,38,39,40,41. L'administration systémique sûre de CBLB502 a été démontrée chez les rongeurs, les primates non humains et les humains35,42,43 (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT01527136) une avancée potentiellement significative par rapport au traitement avec des agonistes d'autres membres de la famille TLR dans le cadre du traitement du cancer44,45,46 (https://ClinicalTrials.gov/show/NCT00960752). Ici, nous avons exploré des combinaisons d'agonistes du TLR5 et de thérapie par point de contrôle immunitaire (ICT) en utilisant le modèle de tumeur solide du cancer du sein immunogène 4T1 et le modèle de tumeur du mélanome B16-F10 peu immunogène, à la fois des cancers très agressifs et réfractaires aux thérapies standard. Toute démonstration de survivants à long terme dans ces modèles serait considérée comme une avancée digne de nouveaux efforts de traduction.

Pour évaluer l'activation de NF-κB médiée par les flagelles et CBLB502 des cellules de carcinome mammaire 4T1, nous avons transfecté de manière stable des cellules 4T1 avec un rapporteur transcriptionnel κB5: IκBɑ-FLuc composé d'une région promotrice κB5 concaténée, suivie du gène rapporteur de fusion bioluminescent IκBɑ-FLuc50,51. Ce rapporteur fournit une lecture de la dégradation endogène de l'IκBɑ induite par le ligand et de la production d'une nouvelle protéine de fusion IκBɑ-FLuc51, produisant un signal dynamique à deux phases. Dans le cytoplasme, IκBɑ séquestre et inactive les dimères NF-κB. La liaison de la flagelline (ou CBLB502) au TLR5 à la surface de la cellule initie l'activité kinase médiée par IKK, ainsi que la phosphorylation, l'ubiquitination et le ciblage ultérieurs pour la dégradation protéasomique de l'IκBɑ endogène ainsi que de la protéine de fusion rapporteur32,51. Comme prévu par ce mécanisme, cela a entraîné une réduction de l'activité bioluminescente au cours des 100 premières minutes dans les cultures traitées à la flagelline (Fig. 1a, flèche rouge) et des 80 premières minutes dans les cultures traitées au CBLB502 (Fig. 1b, flèche rouge). Par la suite, les dimères NF-κB libérés se transloquent vers le noyau et se lient à la région promotrice κB5 du rapporteur, initiant la transcription et la traduction de nouvelles protéines de fusion bioluminescentes. Cela a entraîné une deuxième phase d'augmentation du signal bioluminescent (Fig. 1a, b, flèches vertes), qui, après une période de temps suffisante, est revenue à un état homéostatique comme observé précédemment avec d'autres ligands activateurs de NF-κB. Dans l'ensemble, l'incubation de cellules 4T1 avec de la flagelline ou du CBLB502 a entraîné une dégradation dépendante de la concentration et une resynthèse ultérieure du rapporteur de fusion IκBα-FLuc reflétant le cycle de signalisation NF-κB (Fig. 1a, b). La concentration efficace demi-maximale (EC50) pour la flagelline et CBLB502 était > 104 ng/mL et 3,1 ng/mL, respectivement, dans cette lignée cellulaire, démontrant directement la puissance accrue de CBLB502 pour activer la voie de signalisation NF-κB (Fig. 1c, d).

Les cellules 4T1 exprimant de manière stable pκB5: IκBαFLuc ont été stimulées avec le ligand indiqué à t = 0 et l'activité de bioluminescence imagée toutes les 5 min pendant 4 h. Les données sont affichées sous forme de valeurs de flux de photons normalisées (moyenne pli-initiale, pli-véhicule). a 4T1 exprimant de manière stable pκB5:IκBαFLuc ont été traitées avec des concentrations croissantes de flagelline : 1 ng/ml (n = 7), 10 ng/ml (n = 2), 50 ng/ml (n = 2), 100 ng/ml (n = 7), 500 ng/ml (n = 7), 750 ng/ml (n = 2), 1 μg/ml (n = 7), 2,5 μg/ml (n = 7), 3 μg/ml (n = 5), 4 μg/ml (n = 5), 5 μg/ml (n = 7), 7,5 μg/ml (n = 5), 10 μg/ml (n = 7) et TNFα 20 ng/ml (n = 7). Les barres d'erreur représentent SEM pour le nombre indiqué d'expériences indépendantes. b Les cellules 4T1 exprimant de manière stable pκB5:IκBαFLuc ont été traitées avec des concentrations croissantes de CBLB502 : 0,1 ng/ml (n = 3), 0,5 ng/ml (n = 3), 1 ng/ml (n = 3), 1,5 ng/ml (n = 3), 2,5 ng/ml (n = 3), 5 ng/ml (n = 3), 10 ng /ml (n = 3), 25 ng/ml (n = 3), 100 ng/ml (n = 3), 1 μg/ml (n = 3) et TNFα 20 ng/ml (n = 3). Les barres d'erreur représentent SEM pour le nombre indiqué d'expériences indépendantes. c La concentration effective demi-maximale (EC50) de flagelline dans les cellules 4T1 est > 104 ng/mL dans ce modèle. d La concentration effective demi-maximale (CE50) de CBLB502 dans les cellules 4T1 est d'environ 3,1 ng/mL dans ce modèle.

L'activation par CBLB502 de la signalisation pro-inflammatoire NF-κB est médiée par TLR535, un activateur connu du système immunitaire inné25. Étant donné que CBLB502 est un puissant activateur de la signalisation NF-κB dans les cellules de carcinome 4T1 (Fig. 1b, d), nous avons testé si CBLB502 était suffisant pour provoquer des changements stimulants dans le profil des cytokines des cellules 4T1. Nous avons mesuré des réseaux de protéines de 62 cytokines de souris sécrétées dans des milieux conditionnés à partir de cellules rapporteurs 4T1 en réponse à un traitement pendant la nuit avec CBLB502 (1 µg/mL). La Fig. 1a supplémentaire a identifié de nombreuses cytokines régulées à la hausse qui activent l'immunité innée (par ordre de pli sur le contrôle): SCF (97 fois), sélection L (29 fois), CCL11 (7 fois), IL-3 et son récepteur IL-3RB (respectivement 4 et 7 fois), CCL9 (7 fois), CCL20 (6 fois), (IL-12 p40 / p70 (5 fois), CCL2 (5 fois), Leptine-R (4 fois), CCL3 (4 fois), IGFBP-5 (3 fois), CCL19 (3 ​​fois) et TNF-α (2 fois), tandis que certains exercent des fonctions de régulation immunitaire plus larges, telles que VEGF (3 fois), G-CSF (2 fois) et IL-2 (3 fois) (tableau supplémentaire 1). 0,3 fois), CD40 (0,4 fois) et IL-4 (0,6 fois) ont montré des niveaux diminués (Fig. 1a supplémentaire et Tableau supplémentaire 1). Parmi ces cytokines, CXCL1, CXCL5 et CCL2 ont montré une augmentation statistiquement détectable par rapport au véhicule témoin (bilatéral, p ≤ 0,05) (Fig. 1b supplémentaire). Il convient de noter que ces cytokines sont connues pour être che moattractants pour les composants de l'immunité innée tels que les neutrophiles et les monocytes53,54,55,56. Dans l'ensemble, l'incubation de CBLB502 (1 µg/mL) a reprogrammé le profil de signalisation des cytokines cellulaires en régulant à la hausse de nombreuses cytokines pro-inflammatoires et innées recrutant l'immunité.

Ensuite, nous avons étudié si l'administration de flagelline ou de CBLB502 pouvait déclencher des réponses antitumorales dans un modèle de tumeur syngénique triple négatif du cancer du sein 4T1 in vivo. Des carcinomes à cellules mammaires ont été générés chez des souris BALB/c (âgées de 5 à 6 semaines) par injection orthotopique de cellules tumorales 4T1 FUGW-FL dans le quatrième coussinet adipeux mammaire droit. La progression tumorale de chaque souris a été évaluée chaque semaine à l'aide de l'imagerie par bioluminescence (BLI) et de mesures au pied à coulisse du volume de la tumeur (Fig. 2a – h supplémentaire). Le signal bioluminescent a été détecté une semaine après l'injection orthotopique, confirmant l'implantation réussie de la tumeur. Les tumeurs étaient palpables et affichaient un fort signal de bioluminescence deux semaines après l'injection orthotopique, indiquant une croissance tumorale robuste. Les souris ont ensuite été randomisées en quatre contrôles de traitement différents : contrôle du véhicule, traitement ICT (anti-PD-1 et anti-CTLA-4), flagelline ou CBLB502, et flagelline ou CBLB502 en association avec un traitement ICT à la dose indiquée (tableau 1) et méthode d'administration (tableau supplémentaire 2).

La survie globale combinée à partir de quatre expériences indépendantes est illustrée à la Fig. 2a. Toutes les souris sous contrôle du véhicule (n = 25) ou sous traitement ICT uniquement (n = 23) sont mortes à la fin de l'étude, confirmant le statut réfractaire aux ICT du modèle de cancer du sein 4T1. Il convient de noter qu'une souris traitée par le véhicule a été identifiée comme une valeur aberrante à l'aide de la méthode ROUT pour avoir une faible mesure du flux de photons à la semaine 2 avant le début du traitement et a été omise de l'étude. Des souris sans tumeur ont été observées dans le traitement intratumoral à la flagelline seule (10 µg/souris dose initiale) (n = 22) (un survivant, p = 0,06, test du log-rank) et dans le traitement intratumoral flagelline + ICT (n = 22) (trois survivants, p = 0,001, test du log-rank) (Fig. 2a). Les souris sous contrôle du véhicule et les contrôles de traitement à la flagelline uniquement ont montré un signal bioluminescent stable avec des augmentations des volumes tumoraux (Fig. 2a, c supplémentaires). Fait intéressant, les souris traitées par ICT (souris traitées par ICT uniquement ou flagelline + ICT) ont montré une forte diminution de la signalisation bioluminescente une semaine après le début du traitement (Fig. 2b, d, panneau de gauche supplémentaires) ; cependant, la diminution de la signalisation bioluminescente ne s'est pas accompagnée d'une diminution globale du volume tumoral (Fig. 2b, d, panneau de droite supplémentaires). Au moins deux possibilités pourraient expliquer cette observation : la mort des cellules tumorales accompagnée d'une augmentation de l'infiltrat immunitaire cellulaire ou la perte sélective ou l'extinction de la cassette bioluminescente. Bien qu'ils ne soient pas mutuellement exclusifs, ces résultats ont globalement mis en évidence un remodelage induit par les TIC dans le microenvironnement tumoral avec d'abondants infiltrats de cellules immunitaires, ce qui n'était pas prédictif de la survie en soi.

une analyse de survie de Kaplan – Meier de souris BALB / c implantées avec des cellules rapporteurs orthotopiques 4T1 FUGW-FL fluorescentes et bioluminescentes à la semaine 0 et traitées avec de la flagelline avec ou sans ICT de la semaine 2 à la semaine 4. Les souris traitées avec le contrôle du véhicule (PBS) (n = 25), ICT (n = 23), flagelline (n = 22) et traitement flagelline + ICT (n = 22) ont été comparés. Le traitement par flagelline + traitement ICT a eu un effet statistiquement significatif sur la survie (p = 0,0002, test du Log-rank ; p = 0,003, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon) par rapport au traitement avec un véhicule témoin. Le traitement avec uniquement des TIC a également montré un effet statistiquement significatif sur la survie (p = 0,01, test du Log-rank ; p = 0,03, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon) par rapport au traitement avec un véhicule témoin. Cependant, toutes les souris traitées par ICT étaient mortes à la huitième semaine. Le traitement avec la flagelline seule n'a pas montré de différence détectable (p = 0,06, test du log-rank ; p = 0,08, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon) par rapport au traitement avec le contrôle du véhicule. (b) Le traitement combiné avec CBLB502 (faible dose) et ICT améliore la survie. Analyse de Kaplan-Meier de la survie de souris BALB/c implantées avec des cellules tumorales rapporteurs fluorescentes et bioluminescentes orthotopiques 4T1 FUGW-FL à la semaine 0 et traitées avec CBLB502 (faible dose) avec ou sans ICT de la semaine 2 à la semaine 4. ) + TIC (n = 30) ont été comparés. Le traitement CBLB502 (faible dose) + ICT a eu un effet statistiquement détectable sur la survie (p = 0,002, test du Log-rank ; p = 0,001, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon) par rapport au traitement avec véhicule témoin. Le traitement ICT seul n'a pas montré de différence statistique détectable par le test Log-rank (p = 0,1), mais a montré une différence statistique détectable avec le test Gehan – Breslow – Wilcoxon (p = 0,04). Le traitement au CBLB502 (faible dose) seul n'a pas montré de différence statistique détectable (p = 0,8, test du log-rank ; p = 0,3 test de Gehan-Breslow-Wilcoxon). c Analyse de survie de Kaplan – Meier de souris C57BL / 6J implantées avec des cellules B16-F10 au jour 0 et traitées avec CBLB502 avec ou sans ICT trois jours après l'implantation de la tumeur. Les souris traitées avec le contrôle du véhicule (PBS) (n = 20), ICT (n = 15), CBLB502 (n = 14) et CBLB502 + traitement ICT (n = 39) ont été comparées. Le traitement par CBLB502 + traitement ICT a eu un effet statistiquement significatif sur la survie (p = 0,003, test du Log-rank ; p = 0,01, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon) par rapport au traitement avec le véhicule témoin. d Analyse de survie de Kaplan–Meier de souris BALB/c Tlr5+/+ ou Tlr5−/− implantées avec des cellules tumorales rapporteurs orthotopiques 4T1 FUGW-FL fluorescentes et bioluminescentes à la semaine 0 et traitées avec un véhicule témoin (PBS) (n = 7, pour chaque cohorte de véhicules), ICT (n = 2 et n = 4 pour les souris Tlr5+/+ et Tlr5-/- respectivement), CBLB502 (n = 2 et n = 5 pour les souris Tlr5+/+ et Tlr5−/− respectivement) et le traitement CBLB502+ICT (n = 10, pour chaque cohorte CBLB502 + ICT) ont été comparés. Les souris Tlr5+/+ traitées avec CBLB502 (faible dose) + ICT ont eu un effet statistiquement détectable sur la survie par rapport aux souris Tlr5+/+ traitées avec le véhicule témoin (p < 0,001, test du Log-rank ; p < 0,01, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon) ou aux souris Tlr5-/- traitées avec CBLB502 (it) + ICT (p < 0,001, test du Log-rank ; p < 0,001, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon). Les souris Tlr5+/+ traitées avec le véhicule témoin ont montré une différence statistique détectable de survie par rapport aux souris Tlr5−/− traitées avec le véhicule témoin (p < 0,03, test du log-rank ; p < 0,03, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon).

Étant donné que CBLB502 a montré une plus grande puissance et efficacité pour l'activation de la signalisation NF-κB que la flagelline (Fig. 1b, d) et que CBLB502 a stimulé / recruté des cytokines activatrices immunitaires innées (Fig. 1a, b et tableau supplémentaire supplémentaires 1), nous avons testé si le traitement intratumoral avec CBLB502 (faible dose) pouvait provoquer une réponse antitumorale plus forte que le traitement intratumoral avec la flagelline. La survie globale combinée à partir de quatre expériences indépendantes (tableau supplémentaire 2) est illustrée à la figure 2b. Une souris du groupe témoin du véhicule (n = 22) était de manière inattendue sans tumeur à la fin de l'expérience. Cette souris a montré un signal bioluminescent comparable au cours des deux premières semaines après l'implantation de la tumeur, indiquant que suffisamment de cellules ont été implantées pour la croissance tumorale (Fig. 2e supplémentaire, souris 20). Cependant, il convient de noter qu'aucune tumeur palpable n'a été détectée au cours de l'expérience, ce qui rend probable que la souris ait séquestré les cellules tumorales avant que la tumeur ne puisse établir une croissance significative. Le traitement avec CBLB502 seul (faible dose) (n = 30) a entraîné un signal bioluminescent stable et une croissance tumorale sans survivants (Fig. 2g supplémentaire). Le traitement ICT seul (n = 25) a donné une souris sans tumeur (Fig. 2f supplémentaire, souris 23) et une souris qui a d'abord semblé répondre au traitement, mais a ensuite développé lentement une tumeur (Fig. 2f supplémentaire, souris 18). Conformément aux résultats précédents, les souris traitées par ICT (ICT uniquement ou CBLB502 (faible dose) + traitements ICT) ont montré une forte diminution du signal bioluminescent une semaine après le début du traitement (Fig. 2f, h supplémentaires), ce qui correspond à une perte initiale significative de cellules tumorales 4T1. Plus important encore, le traitement CBLB502 (faible dose) + ICT a donné 20 % de souris sans tumeur (n = 30) (p = 0,001, test du Log-rank ; p = 0,001, test de Gehan-Breslow-Wilcoxon) (Fig. 2b).

Nous avons testé une dose intratumorale plus élevée de CBLB502 (dose élevée de CBLB502), qui est comparable à la dose administrée aux souris de la cohorte de traitement par flagelline (tableau 1). Dans trois expériences indépendantes (tableau supplémentaire 2), le traitement avec CBLB502 (dose élevée) a entraîné une souris sans tumeur dans le traitement CBLB502 (dose élevée) uniquement (n = 15) sans survivant dans aucun des autres traitements (véhicule (n = 19), ICT (n = 17), CBLB502 (dose élevée) + ICT (n = 15)) (Fig. 3a – e supplémentaire). Fait intéressant, une souris supplémentaire dans le traitement CBLB502 (dose élevée) uniquement a montré une croissance tumorale retardée (Fig. 3d supplémentaire, souris 3). Le survivant solitaire (Fig. 3d supplémentaire, souris 5) a montré une différence de survie statistiquement détectable par rapport à son véhicule témoin (p = 0, 01, test du log-rank; p = 0, 01, test de Gehan – Breslow – Wilcoxon).

Nous avons en outre exploré si l'administration systémique de CBLB502 (faible dose) via des injections intrapéritonéales (ip) pouvait provoquer une réponse similaire à l'administration intra-tumorale de CBLB502 (faible dose). Dans deux expériences indépendantes (Fig. 4a – e supplémentaire, Tableau supplémentaire 2), le traitement ip + ICT au CBLB502 (faible dose) a entraîné 10 % de survivants à long terme (n = 20) (p = 0,01, test du Log-rank ; p = 0,01, test de Gehan – Breslow – Wilcoxon) (Fig. 4e supplémentaire, souris 1 et 5). Alors que le contrôle du véhicule (n = 8) et le CBLB502 seul (faible dose, administration ip, n = 20) n'ont donné aucun survivant à long terme (Fig. 4b, d supplémentaires), les souris traitées par ICT (n = 6) ont donné un survivant à long terme dans cette expérience (p = 0,4 et test du log-rank ; p = 0,3 test de Gehan – Breslow – Wilcoxon, par rapport au témoin du véhicule) (Fig. 4c supplémentaire, souris 3).

Nous avons en outre étudié si le traitement combiné de CBLB502 et d'ICT pouvait également provoquer des réponses antitumorales dans une tumeur faiblement immunogène, telle que le modèle de tumeur de mélanome B16-F10. Des tumeurs de mélanome ont été générées chez C57BL / 6J (âgés de 6 à 9 semaines) par injection sous-cutanée de cellules tumorales B16-F10 dans le flanc dorsal droit. Trois jours après l'implantation de la tumeur, les souris ont été randomisées dans quatre contrôles de traitement différents : contrôle du véhicule, ICT (anti-PD-1 et anti-CTLA-4), traitement CBLB502 et CBLB502 en association avec le traitement ICT à la dose et à la méthode d'administration indiquées (tableau supplémentaire 3). La survie globale de quatre expériences indépendantes est illustrée à la Fig. 2c. La progression tumorale de chaque souris a été évaluée toutes les deux semaines à l'aide de mesures au pied à coulisse du volume tumoral (Fig. 5 supplémentaire). Sur quatre expériences indépendantes, une souris témoin véhicule n'a pas développé de tumeur palpable pendant la durée de l'expérience (Fig. 5a supplémentaire, souris 18). Toutes les souris de traitement ICT uniquement (n = 15) sont mortes à la fin de l'étude (Fig. 5b supplémentaire), confirmant le statut réfractaire aux ICT du modèle de tumeur de mélanome B16-F10 sans l'ajout d'un vaccin57. Une seule souris dans le traitement CBLB502 (n = 14) n'a pas développé de tumeur à la fin de l'étude (Fig. 5c supplémentaire, souris 14). Cependant, les courbes de survie n'ont montré aucune différence statistique détectable avec le groupe témoin du véhicule (p = 0, 5, test du log-rank; p = 0, 3, test de Gehan – Breslow – Wilcoxon) (Fig. 2c). Le traitement combiné avec CBLB502 et ICT a donné 25 % de souris sans tumeur (n = 39) à la semaine 78 de l'étude (p = 0,001, test du log-rank ; p = 0,003, test de Gehan – Breslow – Wilcoxon) (Fig. 2c et Fig. 5d supplémentaire). Ainsi, un traitement combiné avec des agonistes du TLR5 et des TIC a amélioré la survie in vivo à partir de deux modèles de tumeurs réfractaires aux TIC indépendants.

Nous avons testé si les récepteurs hôtes TLR5 sont nécessaires pour déclencher la réponse anti-tumorale observée chez les souris traitées avec CBLB505 en combinaison avec des traitements ICT (Fig. 2d)). Les souris Tlr5+/+ et Tlr5–/– ont été provoquées avec 4T1 FUGW-FL (Tlr5+/+) et traitées comme dans les expériences précédentes (tableau supplémentaire 4). La courbe de survie de Kaplan – Meier de deux expériences indépendantes est illustrée à la Fig. 2d. Toutes les souris sous contrôle du véhicule sont mortes à la fin de l'étude (Fig. 6a, e supplémentaires). Cependant, il convient de noter que la courbe de survie des souris témoins véhicule Tlr5–/– (n = 7) a montré une différence significative par rapport à la courbe de survie des souris témoins véhicule Tlr5+/+ (n = 7) (p = 0,03, test Log-rank ; p = 0,03, test Gehan-Breslow-Wilcoxon) (Fig. 2d). Toutes les souris traitées par ICT ou CBLB502 dans les deux groupes de cohorte étaient mortes à la semaine 6 (Fig. 6b, c, f et g supplémentaires). Conformément aux résultats précédents (Fig. 2b), les souris Tlr5 + / + traitées avec CBLB502 (faible dose) + traitements ICT ont donné 20% de souris sans tumeur (n = 10) (Fig. 2d et Supplémentaire Fig. 6d, souris 2 et 4). Alors que toutes les souris Tlr5–/– traitées avec CBLB502 (faible dose) + traitements ICT sont décédées à la fin de l'étude (n = 10) (p = 0,001, test du Log-rank ; p = 0,01, test de Gehan – Breslow – Wilcoxon, par rapport aux souris Tlr5+/+ traitées avec CBLB502 (faible dose) + traitements ICT) (Fig. 2d et Fig. 6h supplémentaire). Ces résultats indiquent que les récepteurs hôtes TLR5 sont nécessaires pour les réponses anti-tumorales observées chez les souris traitées avec les traitements CBLB502 et ICT.

Les souris qui ont montré une régression complète de la tumeur ont été remises au défi par des injections orthotopiques de cellules 4T1 FUGW-FL dans le quatrième coussinet adipeux mammaire opposé (gauche) sans aucune thérapie supplémentaire (tableau supplémentaire 5). La figure 3a montre la survie globale de l'expérience de re-défi. Toutes les souris témoins non traitées, naïves de tumeur, porteuses de tumeur et appariées selon l'âge sont mortes à la sixième semaine, confirmant le potentiel agressif de la cohorte de cellules tumorales, alors que 80 % des souris réintroduites étaient exemptes de tumeur pendant au moins 60 semaines après l'implantation de la tumeur (Fig. 3a – c). Une souris re-challengée a été exclue de la courbe de survie illustrée à la Fig. 3a car la cause du décès n'était pas liée à l'implantation de la tumeur (Fig. 2e supplémentaire - véhicule, souris 20, décédée lors du prélèvement sanguin pour le profilage des cytokines à la troisième semaine). De plus, une semaine après le nouveau défi, cette souris a montré un signal bioluminescent comparable à celui d'autres souris de nouveau défi (Fig. 7 supplémentaire), indiquant une implantation tumorale réussie. Cependant, aucun signal bioluminescent ou tumeur palpable n'a été détecté par la suite au cours des trois premières semaines de l'expérience, indiquant que la souris a probablement rejeté l'implantation tumorale 4T1 FUGW-FL. Néanmoins, dans l'ensemble, ces résultats ont indiqué que les effets curatifs observés étaient probablement dus à la mémoire acquise pour l'immunité anti-tumorale.

une analyse de survie de Kaplan – Meier de souris BALB / c qui ont survécu au moins 18 semaines après l'implantation de la tumeur 4T1 FUGW-FL et n'ont montré aucun signe de tumeur, mais ont été à nouveau testées avec des cellules tumorales orthotopiques 4T1 FUGW-FL dans le quatrième coussinet adipeux mammaire controlatéral (gauche) (n = 15) et des souris témoins naïves de tumeur du même âge (n = 14). Toutes les souris ont reçu une injection à la semaine 0 de cellules tumorales 4T1 FUGW-FL et on a laissé les tumeurs se développer sans intervention thérapeutique. Les souris re-challengées ont montré un taux de survie de 80% (p = 0, 0001, test du log-rank; p = 0, 0001 Gehan – Breslow – Wilcoxon). b Taille de la tumeur des souris naïves de tumeur (n = 14) mesurée par imagerie par bioluminescence (flux total de photons, panneau de gauche) et mesures d'épaisseur (volume de la tumeur, panneau de droite). Toutes les souris naïves de tumeur, défiées par la tumeur, sont mortes à la semaine 6. c Taille tumorale des souris re-défiées (n = 15) mesurée par imagerie par bioluminescence (flux total de photons, panneau de gauche) et mesures d'épaisseur (volume de la tumeur, panneau de droite). Seules trois souris survivantes de la tumeur sont mortes en raison de la charge tumorale : Figure supplémentaire 2f-souris 23 (ICT), Figure supplémentaire 2h-souris 1 (CBLB502 1 µg (it) + ICT) et Figure supplémentaire 3d-souris 5 (CBLB502 10 µg (it)) et, (Tableau supplémentaire 5). Toutes les autres souris survivantes de la tumeur étaient exemptes de tumeur pendant au moins 60 semaines après la nouvelle provocation de la tumeur orthotopique.

Pour approfondir notre compréhension des mécanismes de réponse et caractériser les changements induits par les thérapies ICT et CBLB502 seules ou en combinaison, nous avons dosé 32 cytokines à diffusion hématogène périphérique provenant de souris sans tumeur appariées selon l'âge (souris en bonne santé, pas d'implantation de tumeur) et de souris porteuses de tumeur 4T1 FUGW-FL dans nos cohortes de traitement : porteuses de tumeur, contrôle du véhicule ; porteur de tumeur, échec du traitement ; et porteurs de tumeurs, répondeurs au traitement (Fig. 8a – e supplémentaires), au cours de la semaine 3 (Fig. 4a) et de la semaine 10 (Fig. 8f supplémentaire) et des semaines 5 à 7 (Fig. 4c) pour les cohortes de souris porteuses de tumeur 4T1 FUGW-FL uniquement. Il convient de noter que les souris saines sans tumeur ont montré une expression variable des cytokines entre les semaines 3 et 10 de l'étude, reflétant probablement des changements physiologiques dans l'expression des cytokines (Fig. 4a et Supplémentaire Fig. 8f, souris sans tumeur).

une carte thermique de 32 cytokines du sang périphérique de souris sans tumeur et de souris provoquées par des tumeurs 4T1 FUGW-FL trois semaines après l'implantation de la tumeur orthotopique : souris sans tumeur (souris saines, pas de tumeur implantée) ; souris porteuses de tumeurs, contrôle du véhicule (PBS) (non-survivants), souris porteuses de tumeurs, échec du traitement (non-survivants) et souris porteuses de tumeurs, survivants à long terme. b Parcelle volcanique mettant en évidence la différence statistique détectable entre les cytokines du sang périphérique trois semaines après la provocation tumorale orthotopique. c Carte thermique de 32 cytokines du sang périphérique de souris provoquées par des tumeurs 4T1 FUGW-FL 5 à 7 semaines après l'implantation de la tumeur : souris porteuses de tumeurs, contrôle du véhicule (PBS) (non survivants) à la semaine 5 ; souris porteuses de tumeurs, échec du traitement (non-survivants), semaines 5 à 7 ; et souris porteuses de tumeurs, survivantes à long terme au cours des semaines 6 et 7. d Parcelle de volcan mettant en évidence la différence statistique détectable entre les cytokines du sang périphérique prises entre 5 et 7 semaines après la provocation tumorale orthotopique. e Carte thermique de 32 cytokines du sang périphérique de souris soumises à une nouvelle provocation avec une tumeur 4T1 FUGW-FL : souris naïves de tumeur, porteuses de tumeur (non survivantes), souris survivantes de la tumeur, échec de la nouvelle provocation (non survivantes) et souris survivantes de la tumeur, survivantes à la nouvelle provocation (survivantes à long terme) prises trois semaines après l'implantation orthotopique de la tumeur 4T1 FUGW-FL. f Diagramme volcanique mettant en évidence la différence statistique détectable entre les cytokines circulantes dans le sang périphérique prises trois semaines après la nouvelle provocation de la tumeur orthotopique.

Quatre profils ressortent de notre analyse. Tout d'abord, il convient de noter que les niveaux de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), une cytokine impliquée dans la prolifération et la différenciation des granulocytes et des neutrophiles58 et associée à une survie plus faible dans les cancers du col de l'utérus, du poumon non à petites cellules, du côlon, du mélanome et des cancers de la peau59,60,61,62,63, ont montré une augmentation statistique chez les souris porteuses de tumeur, témoin véhicule par rapport aux souris sans tumeur trois semaines après la tumeur 4T1-FUGW-FL implantation (Fig. 4a, b, panneau de gauche, tableau supplémentaire 6) et une diminution statistique par rapport aux souris porteuses de tumeurs, répondeurs au traitement (survivants à long terme) (Fig. 4a, b, panneau du milieu, tableau supplémentaire 6). Bien qu'il n'y ait pas eu de différence statistique entre les souris porteuses de tumeurs qui ont échoué au traitement (non survivantes) et les souris porteuses de tumeurs, répondeurs au traitement (survivants à long terme) trois semaines après l'implantation de la tumeur 4T1 FUGW-FL (Fig. 4a, b, panneau de droite, tableau supplémentaire 6), il y a eu une diminution statistique au cours des semaines 5 à 7 entre ces deux groupes de souris (Fig. 4c, d, panneau de droite, tableau supplémentaire 7). Conformément à ces résultats, les souris porteuses de tumeurs, les répondeurs au traitement ont également montré une diminution statistique au cours des semaines 5 à 7 par rapport aux souris porteuses de tumeurs, contrôle du véhicule (Fig. 4c, d, panneau du milieu, tableau supplémentaire 7). Deuxièmement, CXCL5, une chimiokine impliquée dans le recrutement de cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) dans le microenvironnement tumoral64,65,66,67 et associée à une faible survie dans les cancers du rein, du foie, du pancréas et du col de l'utérus68, a montré une diminution statistique du nombre de souris porteuses de tumeurs qui ont répondu au traitement (survivants à long terme) par rapport aux souris porteuses de tumeurs qui ont échoué au traitement (non-survivantes) trois semaines après l'implantation de la tumeur 4T1 FUGW-FL (Fig. 4a, b, panneau de droite, tableau supplémentaire 6). Troisièmement, nous constatons qu'au cours des semaines 5 à 7 après l'implantation de la tumeur, l'IL-15, une cytokine pro-inflammatoire et immuno-activatrice qui favorise la survie, la différenciation, la prolifération et l'activation des cellules tueuses naturelles (NK), des lymphocytes T CD8+ et des lymphocytes B69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, a montré une augmentation statistique du nombre de souris porteuses de tumeurs qui ont répondu au traitement (survivantes à long terme) par rapport aux souris porteuses de tumeurs qui ont échoué au traitement (non survivantes). ors) (Fig. 4c, d, panneau de droite, tableau supplémentaire 7) ou avec un véhicule témoin de souris porteuses de tumeurs (Fig. 4c, d, panneau du milieu, tableau supplémentaire 7). En revanche, il n'y avait aucune différence statistique entre les souris porteuses de tumeurs, le contrôle du véhicule, et les souris porteuses de tumeurs qui avaient échoué au traitement (non-survivants) (Fig. 4c, d, panneau de gauche, tableau supplémentaire 7). Quatrièmement, bien qu'il n'y ait pas de signification statistique sur la base des tests ANOVA à deux voies, les souris porteuses de tumeurs qui ont répondu au traitement ont montré une tendance globale à l'augmentation des cytokines activatrices du système immunitaire par rapport aux souris porteuses de tumeurs qui ont échoué au traitement pendant les semaines 5 à 7 après l'implantation de la tumeur : GM-CSF (11 fois)76, IL-2 (15 fois)77, IL-13 (8 fois)78, IFN-γ (7 fois)79 et CCL3 (quatre -pli)80. Il convient de noter que CXCL1, une chimiokine associée à l'immunosuppression tumorale81, a montré une augmentation de 4 fois par rapport aux souris porteuses de tumeurs qui ont échoué au traitement (tableau supplémentaire 7). L'IL-10, une cytokine impliquée dans la suppression immunitaire par l'inhibition des cellules présentatrices d'antigène (APC) et l'activation des cellules T-reg immunosuppressives, a montré une diminution du double chez les souris qui ont répondu au traitement par rapport aux souris qui ont échoué au traitement (tableau supplémentaire 7). Fait intéressant, les antagonistes de l'IL-10 sont actuellement explorés en tant que thérapie immunitaire anti-tumorale en association avec des agonistes du TLR et d'autres traitements immunostimulateurs83. Enfin, les souris porteuses de tumeurs qui ont répondu au traitement (survivants à long terme) ont montré des augmentations statistiques de l'IL-1α, de l'IL-15, du CXCL5 et de l'IL-12 p40 par rapport aux souris témoins sans tumeur, indiquant un profil distinctif des cytokines systémiques d'activation immunitaire dix semaines après l'implantation de la tumeur 4T1 FUGW-FL (Fig. 8f, g supplémentaires).

Les cytokines de souris tumorales et naïves de tumeur ont été dosées trois semaines après l'implantation de 4T1 FUGW-FL. Les souris sans tumeur pendant au moins 60 semaines après la nouvelle provocation (souris survivantes de la tumeur, survivantes de la nouvelle provocation) ont révélé un profil de cytokines distinctif par rapport aux souris qui ont été retestées, mais ont développé des tumeurs (souris survivantes de la tumeur, échec de la nouvelle provocation) (Fig. 4a). Fait intéressant, similaire aux résultats précédents avec des souris de provocation (Fig. 4c, d), l'IL-15 a montré une augmentation statistique du nombre de survivants à long terme (souris survivantes de la tumeur, survivantes de la re-provocation) par rapport aux souris qui ont été re-provoquées, mais n'ont pas survécu (souris survivantes de la tumeur, échec de la re-provocation) (Fig. 4e, f, panneau de droite, tableau supplémentaire 8) et avec des souris naïves de tumeur, porteuses de tumeurs qui n'ont pas non plus survécu (Fig. 4e, f, panneau du milieu, Tableau supplémentaire 8). Fait intéressant, les souris re-challenge qui n'ont pas survécu (souris survivantes de la tumeur, échec de la re-challenge) ont également montré une augmentation statistique par rapport aux souris naïves de tumeur, porteuses de tumeur (Fig. 4e, f, panneau de gauche, tableau supplémentaire 8), mais dans une moindre mesure que les survivants à long terme (souris survivantes de la tumeur, survivantes de la re-challenge). De plus, les niveaux de G-CSF ont également eu une tendance à la baisse chez les survivants à long terme (souris survivantes de la tumeur, survivantes d'une nouvelle provocation) (diminués de 19 fois) par rapport aux souris naïves de tumeur et porteuses de tumeur (non survivantes) (tableau supplémentaire 8), mais ces valeurs sont loin d'avoir une signification statistique (ANOVA à deux facteurs). Les souris qui ont été re-challengées, mais qui n'ont pas survécu (souris survivantes de la tumeur, échec de la re-challenge), ont montré des niveaux similaires de G-CSF à ceux des souris naïves de tumeur et porteuses de tumeur à ce moment (tableau supplémentaire 8). Par ailleurs, quatre profils ressortent de notre analyse. Tout d'abord, les cytokines qui ont été régulées à la fois chez les souris ayant échoué à la re-provocation et chez les souris survivantes de la re-provocation, mais avec une augmentation beaucoup plus importante du nombre de survivants à la re-provocation : LIF (5 fois contre 420 fois), CXCL1 (3 fois contre 120 fois), IL-2 (7 fois contre 260 fois), IL-7 (100 fois contre 3700 fois), IL-12 p70 ( 10 fois par rapport à 240 fois), CCL4 (3 fois par rapport à 58 fois), CCL11 (3 fois par rapport à 27 fois), CCL3 (3 fois par rapport à 20 fois), IL-1α (4 fois par rapport à 22 fois), IL-10 (55 fois par rapport à 210 fois), IL-1β (3 fois par rapport à 6 fois), CXCL2 (8 fois par rapport à 17 fois), IL-4 (21 fois contre 41 fois), IL-9 (4 fois contre 7 fois) et M-CSF (40 fois contre 62 fois) (tableau supplémentaire 8). Deuxièmement, les cytokines qui ont été régulées à la baisse dans les deux groupes, mais dans une plus grande mesure dans la cohorte d'échec de re-défi : IL-3 (diminution de 0,4 contre 0,7), IL-5 (diminution de 0,3 contre 0,5) et CXCL10 (diminution de 0,3 contre 0,5) (tableau supplémentaire 8). Troisièmement, les cytokines qui ont montré une régulation différentielle entre les deux cohortes : IL-12 p40 (diminution de 0,4 par rapport à une augmentation par deux), TNFα (diminution de 0,5 par rapport à une augmentation par deux), IL-6 (diminution de 0,7 par rapport à une augmentation par deux) (tableau supplémentaire 8). Quatrièmement, les cytokines qui n'ont pas changé dans une population, mais l'ont fait dans une autre : les souris survivantes à nouveau challenge ont régulé positivement IL-13 (53 fois), CXCL9 (12 fois), IFN-γ (9 fois), CCL5 (trois fois), alors que les souris en échec de re-challenge n'ont pas régulé positivement ces cytokines de plus de deux fois. CXCL5 a montré une diminution de 0,8 des survivants à long terme, mais aucun changement chez les souris qui n'ont pas survécu. L'IL-17 a montré une multiplication par deux du nombre de souris qui n'ont pas survécu, mais aucun changement chez les survivants à long terme (tableau supplémentaire 8). Pris ensemble, ces résultats ont montré un profil adaptatif distinctif de cytokines activant le système immunitaire chez les souris qui ont survécu à l'expérience de re-défi.

Pour élucider davantage les effets des thérapies CBLB502 et ICT seules ou en combinaison, nous avons exploré les modifications du microenvironnement immunitaire tumoral en réponse à ces thérapies et nous avons demandé si les modifications de l'infiltration des cellules immunitaires étaient corrélées à une probabilité accrue de survie. Nous avons utilisé une stratégie unique basée sur le signal de bioluminescence comme outil pronostique pour les résultats de survie des souris qui ont été euthanasiées trois semaines après l'implantation de la tumeur 4T1 FUGW-FL pour l'extraction de la tumeur et le profilage ultérieur de la cytométrie en flux de l'infiltrat immunitaire de la tumeur, en effet à un moment avant que les résultats pour les souris individuelles ne soient connus, mais le signal de bioluminescence serait prédictif.

Le volume tumoral et les mesures BLI ont été des outils utiles pour évaluer la progression tumorale dans les modèles précliniques84,85,86,87. De plus, les mesures BLI ont été utilisées pour évaluer l'efficacité du traitement dans divers modèles animaux88,89. Par conséquent, nous avons exploité les données de survie globale et les mesures de progression tumorale (Fig. 2a, b et Fig. 2 supplémentaire) pour évaluer le potentiel prédictif du résultat de survie de la bioluminescence (flux total de photons) et/ou des mesures du volume tumoral 3 semaines après l'implantation de la tumeur 4T1 FUGW-FL. L'aire sous la courbe (AUC) de la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) a été utilisée pour déterminer la précision diagnostique globale de chaque mesure, en dichotomisant l'ensemble de données en « survivants » et « non-survivants » en fonction de leur survie à 12 semaines90. La figure 5a montre que BLI (flux total de photons Log10 à la semaine 3) avait la meilleure valeur prédictive (AUC = 0,75 ; IC à 95 % 0,6 à 0,9 ; p ≤ 0,001) suivi de près par la taille de la tumeur (AUC = 0,74, IC à 95 % 0,6 à 0,9 ; p ≤ 0,001) (Fig. 5b). Les pentes du volume tumoral de la semaine 2 à 3 ont également été utilisées comme quantificateurs, mais elles n'ont pas atteint la signification (ASC = 0, 6, IC à 95% 0, 5 à 0, 7, p ≥ 2) (Fig. 5c). Il y avait également peu de corrélation entre le log BLI et la charge tumorale, ce qui suggère que des informations supplémentaires pourraient être fournies par chaque mesure. La précision diagnostique prédictive des mesures BLI pour les résultats de survie a indiqué que les souris avec des mesures BLI plus élevées avaient une probabilité de survie réduite et que les souris avec des mesures BLI inférieures avaient une probabilité de survie accrue.

Courbes ROC comparant la sensibilité et la spécificité de la survie globale par une bioluminescence (flux total de photons) à la semaine 3, b volume tumoral à la semaine 3 et c pente du volume tumoral entre les semaines 2 et 3. d Schéma de traitement pour souris euthanasiées utilisé pour le profilage immunitaire tumoral.

Nous avons ensuite examiné les modifications du microenvironnement immunitaire de la tumeur en réponse aux traitements à trois semaines. Les souris porteuses de tumeurs 4T1 FUGW-FL ont été traitées avec CBLB502 ou ICT seuls ou en combinaison pendant une semaine et euthanasiées trois semaines après l'implantation de la tumeur pour la récolte de la tumeur, comme illustré à la Fig. 5d, schéma et tableau supplémentaire 9. +), macrophages, macrophages de type M1 et macrophages de type M2 ou cellules lymphoïdes : cellules B, cellules NK, cellules T CD3+, cellules T CD8+, cellules T CD4+ et cellules T regs (tableaux supplémentaires 10, 11). Les cellules myéloïdes et lymphoïdes ont été identifiées comme décrit dans le tableau supplémentaire 12.

Conformément aux observations antérieures de tumeurs 4T191,92, les cellules myéloïdes (cellules CD11b +) constituaient la majorité des cellules immunitaires (cellules CD45 +) présentes dans les échantillons de tumeurs prélevés sur des souris témoins véhicule (Fig. 9 supplémentaire; panneau de cellules myéloïdes, témoin véhicule). Cependant, des échantillons de tumeurs prélevés sur des souris traitées ont montré une tendance à une variabilité accrue du nombre de cellules myéloïdes (Fig. 9 supplémentaire; panel de cellules myéloïdes, témoins traités). Cette tendance pourrait refléter les réponses immunitaires en cours chez les souris traitées. En effet, les modifications globales du paysage immunitaire tumoral chez les souris traitées sont hétérogènes et peuvent indiquer une activation immunitaire.

Premièrement, nous avons observé qu'une augmentation de la proportion de monocytes (Ly6C +) et de monocytes (Ly6C +, Ly6G +) était corrélée à une augmentation du signal BLI (r = 0, 6, p <0, 001 et r = 0, 7, p <0, 001) (Fig. 6a, b, flèches violet foncé et marron). De plus, une augmentation de la proportion de cellules myéloïdes, de cellules dendritiques, de macrophages de type M1, de cellules T reg et NK était également corrélée à l'augmentation du signal BLI, mais n'atteignant pas la signification statistique (r = 0,4, p > 0,08 ; r = 0,3, p > 0,08 ; r = 0,2, p > 0,4 ; r = 0,01, p > 0,9 ; r = 0,2 , p > 0,4, respectivement) (Fig. 6a, b). L'augmentation du nombre de monocytes Ly6C + et Ly6C +, Ly6G + chez les souris porteuses de tumeurs avec un signal BLI accru est remarquable. Les tumeurs 4T1 sont connues pour être de puissants inducteurs de MDSC monocytaires93,94, une population hétérogène de cellules myéloïdes peu différenciées. Les MDSC sont connues pour supprimer l'activation et la prolifération des cellules T, altérer les fonctions des cellules tueuses naturelles (NK), induire des cellules T reg immunosuppressives et favoriser les états inflammatoires pro-tumoraux en régulant la diaphonie entre les cellules tumorales, les mastocytes et les macrophages95. Conformément à ces résultats, nous avons trouvé une proportion accrue de cellules T CD3 + et de cellules T CD4 + inversement corrélées à l'augmentation du signal BLI (r = -0, 6; p ≤ 0, 01 et r = -0, 5; p ≤ 0, 01) (Fig. 6a, b, flèches vertes et violet clair). De plus, l'augmentation des cellules T CD8 +, des cellules B, des macrophages et des macrophages de type M2 a montré une corrélation inverse avec l'augmentation du signal BLI, bien que les corrélations n'aient pas atteint une signification statistique (r = -0, 3; p> 0, 3, r = -0, 3; p> 0, 2, r = -0, 06; p> 0, 9; r = -0, 4; p> 0, 8, respectivement) (Fig. 6a, b). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent un changement dans l'état du microenvironnement immunitaire tumoral de la suppression immunitaire à l'activation immunitaire chez les souris avec des signaux BLI inférieurs, ce qui provoque une réponse anti-tumorale curative ultérieure.

un profil d'infiltrat immunitaire tumoral myéloïde (panneau supérieur) et lymphoïde (panneau inférieur) du véhicule et des souris traitées, auquel a été attribuée une mesure Log BLI prise 3 semaines après l'implantation de la tumeur 4T1 FUGW-FL et avant l'extraction de la tumeur. b Volcano plot mettant en évidence la corrélation entre l'infiltrat immunitaire et le Log BLI. La ligne verticale délimite les valeurs de corrélation Spearman r négatives et positives. La ligne d'identité indique p = 0,05. Les flèches vertes, violet clair, marron et violet foncé mettent en évidence les cellules T CD3+, les cellules T CD4+, les monocytes (Ly6C+, Ly6G+) et les monocytes (Ly6C+), respectivement, dans les panneaux A et B.

Enfin, nous avons continué à corroborer le potentiel diagnostique du signal Log (BLI) en comparant le profil des cytokines à diffusion hématogène des souris survivantes à long terme (Fig. 4a, b) avec des souris à profil immunitaire (Fig. 8a – e supplémentaire et Tableaux supplémentaires 13–16). Conformément au profil des cytokines du sang périphérique des souris survivantes à long terme, les souris euthanasiées avec un signal Log (BLI) inférieur étaient corrélées à une diminution du G-CSF (r = -0, 8; p ≤ 0, 001) (Fig. 10a, b supplémentaires). Il convient de noter que CXCL5, précédemment identifié comme préjudiciable à la survie (Fig. 4b), n'a pas montré de différences statistiquement significatives : (r = -0,2 ; p > 0,5) (Fig. 10a, b supplémentaires). Cependant, il est possible que la taille de l'échantillon ait limité la capacité de détecter des différences statistiques.

Le carcinome mammaire 4T1 est un modèle murin robuste pour étudier le cancer du sein humain triple négatif, qui est hautement invasif, métastatique et résistant aux thérapies de point de contrôle immunitaire96,97. Nous rapportons ici : (1) le succès du traitement du carcinome mammaire 4T1 murin réfractaire aux ICT établi et du modèle de tumeur de mélanome B16-F10 peu immunogène et réfractaire aux ICT grâce à la combinaison d'ICT standard et d'agonistes TLR5 activateurs immunitaires innés puissants, (2) les récepteurs TLR5 hôtes sont nécessaires pour améliorer la survie chez les souris traitées avec une combinaison d'ICT et d'agoniste TLR5 chez les souris porteuses de tumeurs 4T1, (3) -les traitements liés ont suscité une mémoire immunitaire contre les antigènes tumoraux chez la plupart des survivants à long terme, (4) les profils de cytokines systémiques impliquaient l'engagement de l'immunité innée et adaptative en réponse au traitement, (5) CXCL5 et G-CSF peuvent fonctionner comme des biomarqueurs pour des réponses positives au traitement, (6) IL-15 indique l'engagement de l'immunité adaptative dans le déclenchement d'une réponse anti-tumorale curative, (7) une nouvelle approche qui exploite le signal BLI non invasif comme point médian Le biomarqueur de la progression tumorale à la semaine 3 a servi d'outil prédictif pour les résultats de survie à la semaine 7 ou plus tard, qui a ensuite été utilisé pour identifier les changements dans le microenvironnement immunitaire tumoral à mi-parcours chez les souris individuelles qui étaient le mieux corrélés avec une probabilité accrue de survie, et (8) des diminutions des monocytes (Ly6C+) et des monocytes (Ly6C+, Ly6G+) accompagnées d'une augmentation des lymphocytes T CD3+ et des lymphocytes T CD4+ ont probablement conduit l'état du microenvironnement tumoral de la suppression immunitaire à l'activation immunitaire. En effet, comme la flagelline bactérienne est le ligand natif du TLR5, dans l'ensemble, nos études fournissent un aperçu mécaniste supplémentaire des liens entre la réponse TIC et le microbiote98,99,100,101.

Pris ensemble, ces résultats ont mis en évidence une nouvelle stratégie thérapeutique qui exploite à la fois les composants innés et adaptatifs du système immunitaire pour déclencher une réponse antitumorale durable. D'une part, il a été démontré que la flagelline bactérienne dérivée provoque une réponse antitumorale ciblée en se liant au TLR5, initiant une cascade de signaux qui produisent une réponse pro-inflammatoire via l'activation du facteur de transcription NF-kB32. Ici, nous avons d'abord montré que CBLB502 in vitro, un puissant activateur des voies de signalisation NF-kB, était suffisant pour déclencher une réponse cytokine immunogène médiée par TLR5 dans les cellules tumorales. Étant donné que les déficiences de la présentation antigénique sous-tendent de nombreux mécanismes de résistance contre les TIC, il est possible d'émettre l'hypothèse qu'un puissant activateur de l'immunité innée pourrait moduler l'homéostasie tumorale, faisant passer l'état du microenvironnement tumoral de la suppression immunitaire à l'activation immunitaire (Fig. 7). Plusieurs sources de données appuient ce modèle. Premièrement, seul le traitement avec des flagelles ou CBLB502 en combinaison avec ICT a augmenté la survie chez les souris porteuses de tumeurs 4T1 et B16-F10 hautement réfractaires aux ICT, alors que les monothérapies de flagelline, CBLB502 ou ICT n'ont pas montré d'effets curatifs significatifs. Deuxièmement, les profils des cytokines du sang périphérique des souris porteuses de tumeurs 4T1 qui ont répondu au traitement et ont montré une régression complète de la tumeur reflétaient une réponse antitumorale concertée. Troisièmement, les souris Tlr5−/− n'ont pas répondu à une thérapie combinée comprenant ICT plus agoniste de TLR5, indiquant que les récepteurs TLR5 de l'hôte sont nécessaires pour une meilleure survie. S'il a été montré que les souris porteuses de cellules tumorales dépourvues de TLR5 ne répondent pas au traitement par la flagelline26, il reste à étudier si les flagelles et le CBLB502 peuvent également agir sur les cellules tumorales pour provoquer une réponse immunitaire curative dans le cadre d'un traitement combiné avec les TIC. De plus, il reste à élucider si les récepteurs TLR5 de l'hôte agissent principalement sur les composants de l'axe de l'immunité innée ou pourraient-ils également agir directement sur les composants de l'immunité adaptative pour déclencher des réponses immunitaires durables dans le contexte de l'ICT34. Quatrièmement, presque toutes les souris survivantes qui ont été re-challengées ont rejeté la même tumeur, impliquant une réponse de mémoire adaptative contre les cellules tumorales. Cinquièmement, les profils de cytokines périphériques des souris qui ont été à nouveau testées et ont rejeté la tumeur se sont alignés sur une forte réponse d'activation immunitaire adaptative. Enfin, les changements dans l'infiltrat immunitaire tumoral chez les souris avec une probabilité accrue de survie étaient compatibles avec une activité immunitaire conduisant à une réponse anti-tumorale curative.

Le microenvironnement tumoral des souris BALB/c implantées avec 4T1 FUGW-FL est fortement infiltré par des cellules immunosuppressives favorisant le microenvironnement pro-tumoral (panneau de gauche). L'activation puissante de l'immunité innée par les agonistes du TLR5 en combinaison avec des traitements TIC ciblant PD-1 et CTLA-4 entraîne une augmentation systémique de la cytokine activatrice immunitaire IL-15 et une réduction des cytokines immunosuppressives G-CSF et CXCL5. Concomitamment, une diminution des monocytes (Ly6C+) et des monocytes (Ly6C+, Ly6G+), accompagnée d'une augmentation des lymphocytes T CD3+ et des lymphocytes T CD4+ entraîne une activation immunitaire et une réponse anti-tumorale (panneau de droite).

L'augmentation remarquable des taux de protéines G-CSF transmissibles par le sang chez les souris porteuses de tumeurs qui ont échoué au traitement ou qui ont servi de témoins non traités porteurs de tumeurs ont suggéré que le G-CSF pourrait être exploré en tant que biomarqueur potentiel. Inversement, un faible taux sérique de G-CSF chez les souris porteuses de tumeurs qui ont répondu au traitement ou développé une immunité tumorale à long terme a suggéré une utilité en tant que marqueur prédictif de la réponse au traitement. Ces résultats incitent à la prudence quant à l'utilisation du G-CSF pour prévenir la neutropénie chez les patients cancéreux. Bien qu'une récente étude de méta-analyse ait montré certains avantages du traitement de soutien au G-CSF dans la survie globale des patients recevant une chimiothérapie, les données montrent également un risque accru de développer des tumeurs malignes secondaires102. La thérapie au G-CSF dans le contexte des TIC reste à explorer. De même, il convient de noter que les souris survivantes à long terme ont montré des diminutions statistiquement significatives de CXCL5 par rapport aux souris qui ont échoué au traitement (non-survivantes), ce qui indique que CXCL5 peut également être exploré en tant que biomarqueur de la réponse au traitement et/ou en tant que cible thérapeutique potentielle.

En conclusion, le succès de la thérapie par point de contrôle immunitaire pour susciter des réponses curatives durables contre divers types de cancers chez des sous-groupes de patients fait des efforts louables pour augmenter le nombre de patients qui répondent à ce type de traitement. Les activateurs de TLR5, tels que la flagelline et le CBLB502, en combinaison avec les TIC, peuvent offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques pour les patients qui ne répondaient pas auparavant.

La flagelline de Salmonella typhimurium (FLA-ST) a été achetée chez Invivogen. CBLB502 était un cadeau de Cleveland Biolabs, Inc. Les anticorps monoclonaux 9D9 (anti-CTLA-4) et RPM1-14 (anti-PD-1) ont été achetés auprès de BioX Cell et maintenus dans des stocks de 6,5 et 6,7 mg/mL, respectivement, et stockés à 4 °C avant utilisation. La d-luciférine (d-Luc) (BioGold), le substrat de la luciférase de luciole, a été maintenue dans une solution à 30 mg/mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Matrigel a été obtenu auprès de Corning et maintenu à -20 ° C.

Des cellules de carcinome mammaire 4T1 (ATCC) à 95% de confluence ont été co-transfectées avec 10 µg de pκB5: IκBα-FLuc52 et 3 µg d'ADN plasmidique pIRES-puro en utilisant Fugene 6 (Roche) dans des boîtes de 10 cm (BD Bioscience). Les cultures ont été incubées à 37 ° C et après 24 h, le milieu a été remplacé par du RPMI frais additionné de 10 % de FBS inactivé par la chaleur. 24 h plus tard, les cellules ont été divisées à des dilutions multiples dans un milieu contenant 0,5 µg/ml de puromycine pour sélectionner des transformants stables. Après deux semaines, des colonies de cellules isolées ont été imagées pour confirmer l'expression du gène rapporteur, et des colonies bioluminescentes ont été récoltées et développées. Les cellules rapporteuses ont été cultivées en continu en présence de 0,5 ug/ml de puromycine pour maintenir l'expression du plasmide rapporteur.

Les cellules rapporteurs de carcinome mammaire 4T1 FUGW103 transfectées de manière stable avec le plasmide EF1α: FLuc produisant des cellules rapporteurs d'imagerie double fluorescentes et bioluminescentes constitutives (FUGW-FL) ont été cultivées selon les protocoles ATCC et maintenues sous sélection avec 0, 5 µg / ml de puromycin104. Les cellules parentales B16-F10 ont été cultivées selon les protocoles ATCC105.

Des cellules rapporteurs 4T1 κB5: IκBα-FLuc (7 000 cellules) ont été ajoutées à une plaque à 96 puits et incubées pendant une nuit à 37 ° C. Une heure avant l'imagerie, les milieux cellulaires ont été aspirés et remplacés par du RPMI avec du L-Glutamate (cellules 4T1) additionné de 10 % de FBS inactivé par la chaleur et de 150 µg/ml de d-luciférine (BioGold). Les cellules ont été imagées dans un système d'imagerie IVIS 100, les images étant acquises toutes les 5 min pendant 4 h, sauf indication contraire. Les cellules ont été maintenues dans la chambre d'imagerie par une étape chauffée (37 ° C) et un flux d'air à 5% de CO2. Les paramètres d'acquisition étaient : temps d'acquisition, 60 s ; regroupement, 4–8 ; filtre, ouvert ; arrêt f, 1 ; Champ de vision, 12–23 cm. Stimuli inclus : TNFα (20 ng/ml) (systèmes R&D) ; flagelline (diverses concentrations allant de 1 μg/mL à 0,1 ng/mL) ; CBLB502 (diverses concentrations allant de 1 μg/mL à 0,1 ng/mL) ; et de l'eau sans nucléase (contrôle vectoriel uniquement) ajoutée aux puits en triple. Les données de flux de photons de bioluminescence (photons/sec) représentent la moyenne des puits en triple pour le nombre indiqué d'expériences indépendantes, et ont été analysées par des mesures de région d'intérêt (ROI) avec Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences). Les données ont été importées dans Excel (Microsoft Corp.), moyennées et normalisées aux valeurs initiales (t = 0) (pli initial) et aux témoins traités avec le véhicule (pli-véhicule) pour être présentées dans des graphiques dynamiques50. Les résultats normalisés d'expériences répétées ont été moyennés pour chaque point dans le temps, et les résultats ont été représentés graphiquement sous forme de flux de photons normalisé en fonction du temps, avec l'axe y sur une échelle log2. Les barres d'erreur positives représentent l'erreur standard de la moyenne pour des expériences répétées.

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) du centre de cancérologie MD Anderson de l'Université du Texas ; protocole 00001179-RN01. Des souris femelles BALB/c (âgées de 4 semaines) ont été achetées au Jackson Laboratory. La paire de souris accouplées BALB/c Tlr5−/− était un cadeau de Joon Haeng Rhee, Chonnam National University Medical School, Corée du Sud106. Les BALB/c Tlr5−/− ont été élevés et entretenus par le Département de médecine vétérinaire et de chirurgie du MD Anderson Cancer Center de l'Université du Texas. Des femelles C57BL/6J (âgées de 6 à 9 semaines) ont été achetées au Jackson Laboratory. Les animaux ont eu au moins une semaine pour s'acclimater à l'animalerie avant le début des expériences.

Les souris qui ont atteint le point final (état moribond ou ayant une mesure de tumeur dans le plan sagittal ou axial supérieure à 1,5 cm) ont été euthanasiées, selon les protocoles d'euthanasie de l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center IACUC.

Une allogreffe de carcinome mammaire a été établie chez des souris BALB/c (souris âgées de 5 à 6 semaines) par injection orthotopique dans le quatrième coussinet adipeux mammaire d'environ 10 000 cellules 4T1 FUGW-FL mélangées à du Matrigel dans un rapport de 2:1. Le volume total injecté à chaque souris était de 30 μL.

La flagelline, CBLB502, 9D9 (anti-CTLA-4) et RPM1-14 (anti-PD-1) ont été mis en suspension dans du PBS filtré ; Du PBS filtré a été utilisé comme véhicule témoin. Deux semaines après l'injection orthotopique de cellules FUGW-FL 4T1 dans le coussinets adipeux mammaires, chaque souris a été triée au hasard en groupes recevant un contrôle du véhicule (n = 45, total) ou un traitement avec de la flagelline uniquement (n = 22), CBLB502 uniquement (n = 30), ICT unique . La flagelline ou CBLB502 a été administrée tous les deux jours pendant deux semaines. Toutes les souris réparties en différents groupes de traitement ont montré des niveaux détectables de signal de bioluminescence au cours des semaines 1 et 2 après l'implantation des cellules tumorales 4T1 FUGW-FL, confirmant la présence de tumeurs avant le début du traitement (Figs supplémentaires 2, 3b – e, 4b – e, 6 et 8b – e). Le premier jour de traitement, 10 μg de solution de flagelline dans 50 μL (PBS), ou 10 μg (forte dose) ou 1 μg (faible dose) de solution de CBLB502 dans 50 μL (PBS) ont été administrés en injection intratumorale ou intrapéritonéale à des animaux désignés. Pour chaque traitement ultérieur, 2 μg de solution de flagelline dans 50 μL (PBS) ou 2 μg (forte dose) ou 200 ng (faible dose) de solution de CBLB502 dans 50 μL (PBS) ont été utilisés. L'ICT a été administré les jours 1, 3, 5 et 8 du traitement. Le premier jour, les souris recevant un traitement ICT ont reçu une injection intrapéritonéale de 200 μg dans 100 μL de 9D9 et de RPM1-14 (200 μL au total par souris). Les jours suivants, chaque souris a reçu une injection de 100 μg dans 100 μL de chaque anticorps. Les jours où la flagelline et l'ICT ont été administrés, les souris témoins du véhicule ont reçu deux injections intrapéritonéales de 100 μL de PBS ou une injection intrapéritonéale de 200 μL de PBS et une injection intra-tumorale de 50 μL de PBS. Les jours où seule la flagelline a été administrée, les souris vehicules n'ont reçu qu'une injection intra-tumorale de 50 μL de PBS, et le jour où seule l'ICT a été administrée, elles n'ont reçu que deux injections intrapéritonéales de 100 μL de PBS ou une injection intrapéritonéale de 200 μL de PBS.

Les souris ont été imagées à l'aide du système d'imagerie du spectre PerkinElmer IVIS chaque semaine en commençant une semaine après l'injection orthotopique de cellules 4T1 FUGW-FL dans le coussinet adipeux mammaire. Les souris ont été pesées au début de chaque séance d'imagerie et 165 μg de d-luciférine (préparée à 30 mg/mL dans du PBS) ont été injectés par voie intrapéritonéale par gramme de souris. Les souris ont été imagées dix minutes après l'injection de d-luciférine50.

L'ADN génomique de souris Tlr5+/+ et Tlr5−/− a été obtenu en coupant l'extrémité de la queue de souris à moins de 3 mm. Les échantillons de queue ont été traités à l'aide de DirectPCR Lysis Reagent Tail (Viagen Biotech Inc), suivis d'une PCR (Fig. 11a, b supplémentaires). La région génomique contenant le gène Tlr5 a été amplifiée à l'aide des amorces et du protocole PCR suivants :

Tlr5-WT : 5′-CTA TCT GGC AAC CAG ATT CAC AGC CTC-3′

Tlr5-KO : 5′-CTA AAG CGC ATG CTC CAG ACT GCC TTG-3′

Tlr5-extra : 5′-CAG GTC GTT AAA TAT CCC AGG TGG AAG-3′

Dénaturation initiale, 94 ° C pendant 5 min ; dénaturation, 94 °C pendant 1 min ; recuit, 62 ° C pendant 1 min; extension, 72 °C pendant 1 minute, 30 cycles suivis d'une extension finale, 72 °C pendant 5 min.

Une tumeur de mélanome a été établie chez des souris C57BL / 6J (Jackson Laboratory, souris âgées de 6 à 9 semaines) par injection sous-cutanée dans le flanc dorsal droit d'environ 12 000 cellules B16-F10. Le volume total injecté à chaque souris était de 50 µL de cellules remises en suspension dans du RPMI 1640 avec du milieu L-glutamine (Millipore Sigma).

Trois jours après l'injection sous-cutanée de cellules B16-F10 dans le flanc postérieur droit, chaque souris a été répartie au hasard dans un groupe recevant un traitement avec le contrôle du véhicule, CBLB502 uniquement, ICT uniquement (9D9 plus RPM1-14) ou CBLB502 combiné avec ICT. CBLB502, 9D9 et RPM1-14 ont été mis en suspension dans du PBS filtré, et du PBS filtré a été utilisé comme véhicule témoin. Le CBLB502 a été administré tous les deux jours pendant deux semaines. Le premier jour de traitement, 1 μg dans 50 μL de CBLB502 a été administré en injection intra-tumorale à des animaux désignés. Pour chaque traitement ultérieur, 200 ng dans 50 μL de CBLB502 ont été utilisés. L'ICT a été administré les jours 1, 3, 5 et 8 du traitement. Le premier jour, les souris recevant un traitement ICT ont reçu une injection intrapéritonéale de 200 μg dans 100 μL de 9D9 et de RPM1-14 (200 μL au total par souris). Les jours de traitement suivants, chaque souris a reçu une injection de 100 μg dans 100 μL de chaque anticorps. Les jours où CBLB502 et ICT ont été administrés, les souris témoins du véhicule ont reçu une injection intrapéritonéale de 200 μL de PBS et une injection intra-tumorale de 50 μL de PBS. Les jours où seul le CBLB502 a été administré, les souris vehicules n'ont reçu que 50 μL d'injection intra-tumorale de PBS, et le jour où seul l'ICT a été administré, elles n'ont reçu que 200 μL d'injections intrapéritonéales de PBS.

Le volume de la tumeur a été déterminé en mesurant la longueur (l, mesure la plus longue) et la largeur (w) pour chaque tumeur au moins une fois par semaine avec un pied à coulisse, en utilisant la formule standard du prisme triangulaire pour le volume : V = (l × w2)/2.

Des cellules rapporteurs doubles fluorescentes et bioluminescentes 4T1 FUGW-FL ont été étalées dans des plaques de culture tissulaire de 100 mm (BD) (750 000 cellules par plaque) et incubées pendant une nuit à 37 ° C avec du RPMI complété par 10% de FBS inactivé par la chaleur. Le deuxième jour, les milieux cellulaires ont été aspirés et remplacés par du RPMI sans 10 % de FBS inactivé par la chaleur. Le troisième jour, les cultures ont été traitées soit avec CBLB502 à 1 µg/ml soit avec du PBS comme vecteur témoin en triple. Le quatrième jour, le milieu a été collecté dans des tubes de 15 ml, centrifugé à 2000 tr/min à 4 ° C pendant 10 min. Le surnageant a été dosé en utilisant Mouse Cytokine Antibody Array C series 1000 (RayBiotech).

Les sérums de souris dans les expériences 6, 7 et 8 (tableau supplémentaire 2) ont été obtenus par échantillonnage sous-mandibulaire. Les échantillons ont été laissés coaguler à température ambiante pendant 1 heure, centrifugés à 2000 × g pendant 10 min à température ambiante et les sérums (phase supérieure) ont été collectés dans des tubes Eppendorf. Les sérums de souris de l'expérience 9 (tableau supplémentaire 2) ont été obtenus par prélèvement saphène. Les échantillons ont été collectés dans des tubes de séparation de sérum (Thermo-Fisher), centrifugés à 2000 × g pendant 10 min à 4 ° C et les sérums (phase supérieure) ont été collectés dans des tubes Eppendorf. Tous les échantillons de sérum ont été conservés à -80 °C. Les échantillons de sang ne dépassaient pas 10 % du volume total de sang circulant107.

Des échantillons de sérum ont été analysés au Antibody-Based Proteomics Core du Baylor College of Medicine, Houston, TX. Le noyau utilisait le panel de cytokines Milliplex Mouse 32-Plex (Millipore), qui comprenait les cytokines suivantes : G-CSF, GM-CSF, CCL11, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), IL- 12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, CXCL10, CXCL1-like, LIF, CXCL5, CCL2, M-CSF, CXCL9, CCL3, CCL4, CXCL2, CCL5, TNF-α, VEGF et les contrôles et normes d'étalonnage appropriés. Pour les cytokines avec des valeurs supérieures à la plage, nous avons signalé la valeur observée la plus élevée pour la cytokine correspondante, tandis que pour les valeurs inférieures à la plage, nous avons signalé la valeur la plus basse sur la courbe standard divisée par la moitié108,109.

Les tumeurs et les rates ont été retirées avec des ciseaux ou des forceps et pesées. Les tumeurs ont été coupées en morceaux fins et transférées dans un milieu RPMI (5 % de FBS + HEPES 10 mM) contenant de la collagénase (0,2 mg/mL) (Clostridium histolyticum, Sigma) et les rates ont été mises en suspension dans du PBS. Les tumeurs ont été secouées doucement à 37 ° C pendant 30 min avant la rupture des tissus. Les tissus de la rate et de la tumeur ont été rompus à l'aide d'un tamis cellulaire (nylon de 70 um) (Corning) à l'aide d'un plongeon de seringue. La maille de nylon a été rincée plusieurs fois avec un média. Les échantillons ont été centrifugés (5 min à 1500 tr/min) et remis en suspension dans 1 ml de tampon de lyse RBC (Sigma) pendant 5 min et lavés 2 fois avec un tampon de flux (Thermo Fisher). Les cellules ont été comptées (cellomètre Nexelom), avant la coloration vivante/morte avec Zombie UV (Biolegend), incubées pendant 15 min à température ambiante et lavées 2 fois avec du PBS. Cela a été suivi par le bloc Fc (CD16/CD32, BD Biosciences), la coloration des anticorps et la préparation de contrôles de compensation monochromes (billes de compensation Ultra Comp eBeads, Thermo Fisher). Les échantillons ont été recouverts de papier d'aluminium et conservés à 4 ° C pendant la nuit. La coloration intracellulaire a été réalisée à l'aide d'un tampon de perméabilisation (eBioscience) en conjonction avec l'ensemble de tampons de coloration Foxp3 / facteur de transcription (eBioscience). Des contrôles de fluorescence moins un (FMO) ont été utilisés lorsque cela était indiqué pour faire la distinction entre les cellules colorées positivement et négativement pour FoxP3, Ly6G et Ly6C.

CD45 Violet brillant 650 (30-F11, Biolégende), CD11b Pe-Cy7 (M1/70, Biolégende), CD11c Violet brillant 711 (N418, Biolégende), F4/80 PE-dazzle 594 (BM8, Biolégende), Ly-6G APC-Fire 750 (1A8, Biolégende), Ly-6C Violet brillant 510 ( HK1.4, Biolegend), CD80 Brilliant Violet 650 50 (16-10A1, Biolegend), CD163 PerCP-eFluor 710 (TNKUPL, Biolegend) et CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (tableau supplémentaire 10).

CD45 Alexa Fluor 700 (30-F11, Biolegend), CD19 PerCP/Cy5 (6D5, Biolegend), CD3ε Brilliant Violet 650 (17A2, Biolegend), CD4 PerCP-Cy5.5 (GK1.5, Biolegend), CD49b PE-dazzle 594 (DX5, Biolegend), CD8a Brilliant Violet 510 (53–6. 7, Biolegend), FoxP3 Alexa 647 (3).G3, Thermo-Fisher) et CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (tableau supplémentaire 10).

CD45 Alexa 700 (30-F11, Biolégende), CD11b PerCP/Cyanine5.5 (M1/70, Biolégende), CD11c Violet brillant 510 (N418, Biolégende), F4/80 Violet brillant 785 (BM8, Biolégende), Ly-6G PE/Cy7 (1A8, Biolégende), Ly-6C Violet brillant 605 (HK1. 4, Biolegend), CD80 Brilliant Violet 42 1 (16-10A1, Biolegend), CD163 APC (S15049I, Biolegend) et CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (tableau supplémentaire 11).

CD45 Alexa 700 (30-F11, Biolegend), CD19 PerCP/Cy5.5 (1D3/CD19, Biolegend), CD3ε Brilliant Violet 510 (17A2, Biolegend), CD4 PE/Cy7 (GK1.5, Biolegend), CD49b BV421 (DX5, Biolegend), CD8a Brilliant Violet 711 (53–6.7, Bio légende), FoxP3 Alexa 647 (MF-1 4, Biolegend) et CD285 PE (TLR-5) (ACT5, BD Biosciences) (tableau supplémentaire 11).

La cytométrie en flux a été réalisée à l'aide d'un cytomètre LSRII (Becton Dickinson). Une analyse ultérieure a été effectuée à l'aide de FlowJo 10.7.1 (FlowJo, Becton Dickinson).

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism version 8.0.0 pour Windows, GraphPad Software, San Diego, Californie. La survie globale a été évaluée à l'aide des courbes de Kaplan-Meier110. Le test du log-rank (Mantel-Cox) et les tests de Gehan-Breslow-Wilcoxon ont été utilisés pour comparer les taux de survie entre les traitements. Les courbes ROC ont été calculées pour l'analyse prédictive. Des comparaisons bidirectionnelles Anova et multi-tests t utilisant la méthode Holm – Sidak, avec alpha = 0, 05, ont été utilisées pour déterminer la différence statistique détectable dans les études de cytokines in vitro et in vivo . Le coefficient de corrélation de Pearson (r) a été calculé pour évaluer la corrélation entre la probabilité de survie et la proportion d'infiltrat immunitaire tumoral ; une valeur p bilatérale ≤ 0,05 a été utilisée pour déterminer la signification statistique détectable.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires, y compris les données supplémentaires 1.

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Nous reconnaissons le soutien du Gerald Dewey Dodd, Jr. Endowed Distinguished Chair à l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center. Le noyau de cytométrie en flux et de tri cellulaire du MD Anderson South Campus est soutenu par la subvention de soutien du NCI Cancer Center (P30 CA016672).

Département d'imagerie des systèmes anticancéreux, Université du Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, 77030, États-Unis

Caleb Gonzalez, Sarah Williamson, Seth T. Gammon, Sarah Glazer et David Piwnica-Worms

École de médecine de l'Université nationale de Chonnam, Gwangju, Corée du Sud

Joon Haeng Rhee

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CG, STG et DPW ont conçu des expériences. CG et SW ont réalisé des expériences. CG, SW, STG, SG et DPW ont analysé les données. JHR a offert un réactif. CG, STG et DPW ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont édité le manuscrit.

Correspondance avec David Piwnica-Worms.

L'Université du Texas MD Anderson Cancer Center a déposé une demande de brevet sur les composés et les méthodes décrites dans ce rapport (CG, STG et DPW, inventeurs). Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Shitao Li et Zhijuan Qiu.

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Gonzalez, C., Williamson, S., Gammon, ST et al. Les agonistes de TLR5 renforcent l'immunité anti-tumorale et surmontent la résistance à la thérapie par point de contrôle immunitaire. Commun Biol 6, 31 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04403-8

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Reçu : 20 juin 2022

Accepté : 23 décembre 2022

Publié: 12 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04403-8

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