ANGPTL7, une cible thérapeutique pour l'augmentation de la pression intraoculaire et le glaucome

Communications Biology volume 5, Article number: 1051 (2022) Citer cet article

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Le glaucome est une des principales causes de cécité. Les médicaments actuels contre le glaucome agissent en abaissant la pression intraoculaire (PIO), un facteur de risque de glaucome, mais la plupart des traitements ne ciblent pas directement les changements pathologiques entraînant une augmentation de la PIO, qui peut se manifester par une résistance aux médicaments à mesure que la maladie progresse. Pour identifier les modulateurs physiologiques de la PIO, nous avons effectué une analyse d'association à l'échelle du génome et de l'exome chez plus de 129 000 personnes avec des mesures de la PIO et avons étendu ces résultats à une analyse du risque de glaucome. Nous rapportons l'identification et la caractérisation fonctionnelle de variantes de codage rares (y compris les variantes de perte de fonction) dans ANGPTL7 associées à une réduction de la PIO et à la protection contre le glaucome. Nous avons validé les résultats de la génétique humaine chez la souris en établissant que les souris knock-out Angptl7 ont une PIO basale inférieure (~ 2 mmHg) par rapport au type sauvage, avec une tendance à une PIO inférieure également chez les hétérozygotes. Inversement, l'augmentation des niveaux d'Angptl7 murin par injection dans les yeux de souris augmente la PIO. Nous montrons également que le silençage aigu d'Angptl7 chez les souris adultes abaisse la PIO (~ 2–4 mmHg), reproduisant les observations chez les souris knock-out. Collectivement, nos données suggèrent que ANGPTL7 est important pour l'homéostasie de la PIO et se prête à une modulation thérapeutique pour aider à maintenir une PIO saine qui peut prévenir l'apparition ou ralentir la progression du glaucome.

Le glaucome est l'une des principales causes de cécité irréversible, avec une prévalence mondiale de 3,54 % chez les personnes âgées de 40 à 80 ans, et devrait toucher plus de 111,8 millions de personnes d'ici 20401. Classé comme maladie neurodégénérative, le glaucome se caractérise par la perte progressive des cellules ganglionnaires rétiniennes dans l'œil et l'amincissement du bord neurorétinien de la tête du nerf optique. Les personnes concernées présentent une perte de champ visuel qui s'accompagne d'une augmentation de la pression intraoculaire (PIO) dans la majorité des cas2. Le glaucome primaire à angle ouvert (GPAO) est le sous-type de glaucome le plus courant et a la prévalence la plus élevée chez les personnes d'ascendance africaine (prévalence de 4,2 % en Afrique1).

Les personnes les plus à risque de GPAO sont âgées de plus de 60 ans, ont des antécédents familiaux de glaucome ou sont fortement myopes3,4,5,6. Les caractéristiques anatomiques et physiologiques oculaires mesurables, y compris une faible épaisseur cornéenne centrale (CCT), un rapport cupule/disque accru et une pression intraoculaire élevée (PIO)7 sont corrélées à un risque accru de glaucome et, comme le glaucome8, sont hautement héréditaires4,9,10,11,12,13. Ainsi, ces facteurs de risque quantitatifs, lorsqu'ils sont mesurés sur un grand nombre d'individus, peuvent fournir un ensemble de données bien alimenté pour les études génétiques afin d'élucider l'étiologie du risque et de la progression du glaucome. La dernière étude d'association à l'échelle du génome (GWAS) de la PIO a inclus plus de 130 000 individus et a augmenté le nombre de locus associés à la PIO à plus de 10014,15. Un GWAS16 antérieur a rapporté qu'environ 89 % des loci associés à la PIO à un niveau significatif à l'échelle du génome présentaient des effets directionnels cohérents sur le risque de glaucome, renforçant ainsi l'utilité des facteurs de risque quantitatifs dans la découverte de gènes pour le glaucome.

L'abaissement de la PIO est le pilier de tous les traitements du glaucome, car la PIO continue d'être le seul facteur de risque modifiable pour l'apparition ou la progression du glaucome. Bien que de nombreux agents abaissant la PIO topiques efficaces dans plusieurs classes de médicaments soient disponibles, ils présentent des inconvénients importants, notamment une mauvaise observance en raison des exigences de dosage fréquentes et des effets secondaires17. Une efficacité décroissante au fil du temps et le besoin conséquent d'escalader le traitement sont également observés, peut-être en partie parce que la majorité des médicaments utilisés ne traitent pas les changements physiopathologiques au site principal de la régulation de la PIO et de la sortie de l'humeur aqueuse de l'œil, le réseau trabéculaire (TM). Ces limitations se traduisent par une grande proportion de régimes de traitement du glaucome comprenant plus d'un agent thérapeutique et des patients changeant fréquemment de médicaments ou nécessitant une escalade de traitement qui implique finalement une chirurgie invasive pour maintenir une PIO cliniquement acceptable18. Par conséquent, un besoin substantiel non satisfait demeure dans le traitement du glaucome pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques offrant de nouveaux mécanismes d'action, ainsi que des plateformes de traitement qui peuvent offrir une durabilité et une tolérabilité accrues sans compromettre la sécurité.

Nous avons effectué des analyses d'association génétique de la PIO et du glaucome dans huit cohortes afin d'identifier les variantes rares et codantes qui modulent le risque de glaucome par la PIO. Cela a conduit à l'identification d'ANGPTL7 comme candidat, conformément aux conclusions rapportées récemment par un autre groupe19. Dans ce rapport, nous (1) renforçons le lien génétique avec la protection contre le glaucome en (i) montrant un effet protecteur constant de la variante Gln175His dans ANGPTL7 dans huit cohortes, (ii) en identifiant un fardeau de variantes faux-sens ultra-rares dans ANGPTL7 associées à des niveaux de PIO réduits, et (iii) en identifiant une variante rare supplémentaire de perte de fonction ANGPTL7 chez les personnes d'ascendance africaine ; nous présentons également (2) la caractérisation in vitro des variants ANGPTL7 identifiés à partir d'analyses génétiques ; et (3) des résultats in vivo montrant que les souris dépourvues d'Angptl7 ont une PIO basale réduite, et que même un renversement partiel d'Angptl7 avec de petits ARN interférents (ARNsi) peut entraîner une baisse de la PIO chez la souris. Nos résultats établissent un rôle important pour ANGPTL7 en tant que régulateur physiologique de la PIO et suggèrent qu'il est également susceptible d'être modifié par des outils pharmacologiques, ce qui en fait une cible incontournable pour un traitement du glaucome.

Nous avons étudié l'effet d'une rare variation altérant les protéines sur la PIO dans deux grandes cohortes, UK Biobank (UKB) et Geisinger DiscovEHR (GHS), comprenant 129 207 personnes d'origine européenne après exclusion des cas avec un diagnostic de glaucome (méthodes, tableau supplémentaire 1). Pour augmenter notre capacité à détecter les associations avec des variants rares, nous avons effectué des tests de charge en agrégeant pour chaque gène toutes les variantes rares (fréquence des allèles mineurs (MAF) < 1%) prédites de perte de fonction (pLOF, défini comme stop-gain, décalage de cadre, donneur d'épissage, accepteur d'épissage, start-loss et stop-loss) et faux-sens (délétères prédits par 5 algorithmes, méthodes supplémentaires). Nous avons observé une association significative à l'échelle du génome (P <5 × 10−8) des variants de l'angiopoïétine 7 (ANGPTL7) avec une PIO réduite (bêtaallélique = -0, 21 SD, P = 5, 3 × 10 −24; Fig. 1a). La charge génétique comprenait 63 variantes rares mais était dominée par deux : une variante faux-sens (Gln175His, MAF = 0,7 %) et une variante stop-gain (Arg177 *, MAF = 0,03 %), qui représentaient respectivement 1 902 et 82 individus sur un total de 2 188 porteurs (Fig. 1b, 2, Fig. 1 supplémentaire). L'exclusion de Gln175His et Arg177 * de la méta-analyse de la charge entre UKB et GHS n'a pas complètement éliminé le signal (bêtaallélique = -0, 23 SD, P = 4, 4 × 10 - 4; Fig. 2 supplémentaire), suggérant que d'autres variantes ultra-rares d'ANGPTL7 sont également associées à une PIO réduite.

a Association d'un agrégat de 63 pLOF et de variantes faux-sens délétères (basées sur 5 algorithmes de prédiction) dans ANGPTL7 avec une PIO réduite chez 129 207 individus d'origine européenne. b Variantes de faux-sens et de perte de fonction prédite (pLOF) dans les niveaux d'ANGPTL7 et de PIO chez les personnes d'origine européenne de UKB. Les graphiques représentent les niveaux de PIO corrélés à Goldmann (PIOg ; moyenne des deux yeux) chez les porteurs de 1 pLOF et de 10 variantes faux-sens dans ANGPTL7 qui sont prédits délétères par cinq algorithmes différents et qui ont au moins cinq porteurs parmi les 101 678 individus séquencés à l'exome avec des mesures de PIO dans la biobanque britannique. Le niveau médian de la PIO chez les porteurs de tous les 49 pLOF et les variants ANGPTL7 faux-sens délétères prédits (14,64 mmHg) est indiqué par la ligne rouge, et la PIO médiane chez les porteurs non variants (15,46 mmHg) est indiquée par la ligne bleue. Les diamants magenta marquent la PIO médiane chez les porteurs de chaque variante. Sous les graphiques se trouvent la plage médiane et interquartile (IQR) de la PIO et le nombre de porteurs variants diagnostiqués avec un glaucome ou de témoins dans UKB (n = 385 040). GHS Geisinger DiscovEHR, UKB UK Biobank, MAF Fréquence des allèles mineurs.

Association des variants Gln175His (a) et Arg177* (c) dans ANGPTL7 avec la PIO, effet mesuré en unités d'écart-type, chez les individus d'origine européenne. b, d Boîtes à moustaches représentant l'IOPg dans la biobanque britannique à travers les génotypes. b Les porteurs hétérozygotes et homozygotes de Gln175His ont une IOPg médiane inférieure de 0,8 mmHg et 4,1 mmHg, respectivement, par rapport aux non-porteurs. d Les porteurs hétérozygotes Arg177 * ont une IOPg inférieure de 1,4 mmHg par rapport aux non-porteurs. GHS Geisinger DiscovEHR, UKB UK Biobank, MAF Fréquence des allèles mineurs.

Dans les analyses à variante unique, Gln175His était associée à une PIO réduite à un niveau significatif à l'échelle du génome (bêtaallélique = -0, 20 SD, P = 3, 1 × 10 −20, Fig. 2a). Les porteurs hétérozygotes et homozygotes de Gln175His dans ANGPTL7 présentaient une réduction de 5, 2% (0, 8 mmHg) et 26, 5% (4, 1 mmHg) de la PIO médiane dans UKB, respectivement (Fig. 2b). La variante Arg177 * était également nominalement associée à une PIO réduite avec une taille d'effet similaire à celle de Gln175His (bêtaallélique = −0, 24 SD, P = 2, 6 × 10–2, Fig. 2c), et les 77 porteurs hétérozygotes d'Arg177 * avaient une diminution médiane de la PIO de 9% (1, 4 mmHg) (Fig. 2d). Arg177* semble être le variant pLOF prédominant dans les populations européennes ; un test de charge limité aux variantes pLOF (15 variantes à travers UKB et GHS) était dominé par Arg177 * (82 des 112 porteurs au total) et était comparable (bêtaallélique = -0, 21 SD, P = 2, 2 × 10 -2; Fig. 3 supplémentaire) à l'association à une seule variante d'Arg177 * avec la PIO.

Nous avons recherché d'autres ancêtres pour des pLOF supplémentaires dans ANGPTL7 et identifié Trp188 *, qui est enrichi chez les personnes d'ascendance africaine (MAF = 0,3%) par rapport aux Européens (MAF = 0,0013%). Nous avons effectué une association de Trp188 * avec la PIO chez des individus d'ascendance africaine de l'UKB et de l'étude Primary Open Angle African American Glaucoma Genetics (POAAGG), suivie d'une méta-analyse. Trp188 * a montré une tendance à une PIO réduite, similaire à Arg177 * et Gln175His, mais cela n'était pas statistiquement significatif (bêtaallélique = -0, 11 SD, P = 5 × 10 -1). Une méta-analyse d'ascendance croisée des variants Arg177 * et Trp188 * a montré une association nominalement significative avec une PIO réduite (bêtaallélique = -0, 21 SD, P = 1, 5 × 10 - 2; Fig. 4 supplémentaire).

En résumé, nous avons observé une association significative de Gln175His dans ANGPTL7 avec une PIO réduite et une association sous-seuil, dans la même direction et d'ampleur similaire, avec des variants de pLOF dans ANGPTL7. En supposant que les variants pLOF provoquent effectivement une perte de fonction protéique, nos données suggèrent que la perte d'ANGPTL7 peut entraîner une baisse de la PIO.

Pour comprendre si les porteurs de variants dans ANGPTL7 seraient également protégés contre le glaucome, nous avons effectué une analyse d'association de Gln175His avec le glaucome dans UKB, GHS, et six études supplémentaires : la cohorte de médecine personnalisée BioMe de Mount Sinai du système de santé Mount Sinai, New York (SINAI), la Malmö Diet and Cancer Study de Malmö, Suède (MALMO), la cohorte FinnGen de Finlande, l'Estonia Biobank de l'Université de Tartu, Estonie (Est BB), l'étude HUNT de Nord-Trøndelag, Norvège (HUNT), et l'étude de la population générale de Copenhague/Copenhagen City Heart Study de Copenhague, Danemark (CGPS-CCHS). Une méta-analyse sur ces huit cohortes a montré une réduction significative du risque de glaucome pour les porteurs de Gln175His (odds ratio (ORallélique) = 0,77, P = 2,7 × 10−6, Fig. 3a). Nous avons également analysé le risque de glaucome chez les porteurs des variants Arg177*/Trp188* plus rares dans une méta-analyse d'ascendance croisée et avons observé une tendance constante à la réduction du risque (ORallélique = 0,87, P = 4,1 × 10–1, Fig. 3b). Pris ensemble, les associations des variantes faux-sens et pLOF dans ANGPTL7 avec une PIO réduite et l'association de la variante faux-sens avec un risque réduit de glaucome suggèrent l'hypothèse que la perte d'ANGPTL7 confère une protection contre le glaucome, et que cet effet est médié par la régulation de la PIO.

a Résultats de la méta-analyse pour Gln175His avec glaucome dans 8 cohortes différentes. b Méta-analyse d'ascendance croisée de Arg177* et Trp188* dans 5 cohortes d'ascendance européenne (EUR) et 3 africaines (AFR). Les variants dans la méta-analyse des cohortes EUR et AFR étaient Arg177* et Trp188*, respectivement. GHS Geisinger DiscovEHR, UKB UK Biobank, SINAI Mt. Sinai Medical School BioMe Biobank, MALMO Malmö Diet and Cancer Study, EstBB the Estonia Biobank at the University of Tartu, HUNT the HUNT study from Nord-Trøndelag, CGPS-CCHS the Copenhagen General Population Study and the Copenhagen City Heart Study, POAAGG Primary Open Angle African-American Glaucoma Genetics, MAF Minor allele frequency.

Nous avons effectué une analyse d'association à l'échelle du phénome (PheWAS) pour comprendre si d'autres traits étaient associés à un fardeau de pLOF et de variantes faux-sens délétères dans ANGPTL7. Nous avons testé l'agrégat de variantes ANGPTL7 pour l'association avec 14 050 et 10 032 traits binaires et quantitatifs dans UKB et GHS, respectivement. Aucune association n'a atteint une signification à l'échelle du phénome (P < 2 × 10–6 après correction de tests multiples pour 24 082 traits au total) dans le GHS. Les seules associations significatives dans l'UKB étaient avec les traits oculaires (tableau 1), en particulier avec une diminution de la PIO compensée par la cornée (IOPcc), une diminution du facteur de résistance cornéenne (CRF) et une augmentation de la puissance de réfraction cornéenne le long des méridiens faibles et forts mesurés à 3 et 6 mm de diamètre. L'effet de ces variantes sur l'IOPcc a été légèrement atténué (-0,17 SD) par rapport à celui sur l'IOPg (-0,23 SD dans UKB), ce qui suggère que l'ANGPTL7 a un certain impact sur les propriétés cornéennes connues pour affecter les mesures de l'IOPg20. L'association observée avec une diminution du CRF est également compatible avec un effet cornéen d'ANGPTL7.

Nous avons utilisé les mesures d'autoréfraction à 3 mm de diamètre pour dériver des mesures d'intérêt clinique, à savoir la puissance de réfraction cornéenne moyenne (mCRP), l'astigmatisme cornéen et l'astigmatisme réfractif (méthodes supplémentaires) et vérifié l'association avec ANGPTL7. Nous avons observé une association significative avec une augmentation de la mCRP (bêtaallélique = 0, 16 SD, P = 1, 1 × 10–13, tableau 1) mais aucune association avec l'astigmatisme cornéen ou réfractif. Nous n'avons pas non plus observé d'associations avec l'équivalent sphérique moyen (MSE ; mesure de l'erreur de réfraction) ou la myopie (soit dérivée de la MSE, soit via le diagnostic de la CIM-10), qui pourraient résulter d'une augmentation de la mCRP (tableau supplémentaire 2). Dans l'ensemble, nos résultats PheWAS montrent que si ANGPTL7 est associé à des changements dans les mesures quantitatives liées à l'anatomie/biomécanique de la cornée, nous n'avons pas détecté de risque accru pour les résultats de maladies connexes que nous pourrions tester. De plus, pLOF et les variantes faux-sens délétères dans ANGPTL7 ne sont associées à aucun trait quantitatif systémique ni à aucun résultat binaire.

Pour comprendre l'impact des variants Gln175His, Arg177* et Trp188* sur l'expression et la sécrétion d'ANGPTL7, nous avons transfecté de manière transitoire des constructions exprimant les protéines humaines de type sauvage (WT), Gln175His, Arg177* et Trp188* dans des cellules HEK293. Nous avons mesuré les niveaux d'ARNm par Taqman, qui a montré des niveaux de transcrit Gln175His et Arg177 * similaires et une tendance à la diminution des niveaux de transcrit Trp188 * par rapport à WT (P = 0, 08; Fig. 5 supplémentaire). Cependant, l'analyse de la protéine intracellulaire à l'état d'équilibre dans le lysat de cellules entières par Western Blot et ELISA a révélé des niveaux accrus de Gln175His par rapport à WT (P <1 × 10–4; Fig. 4c). Comme prévu, Arg177* et Trp188* codent pour des protéines de poids moléculaire inférieur (~30-32 kDa). Aucune différence significative dans les niveaux de protéines de ces deux mutants n'a été révélée par ELISA par rapport à WT (Fig. 4a, c). Comme ANGPTL7 est une protéine sécrétée, nous avons ensuite déterminé les niveaux de WT, Gln175His, Arg177* et Trp188* dans le surnageant cellulaire. L'analyse des protéines par western blot a montré que les variants Arg177 * et Trp188 * n'étaient pas détectables et que le Gln175His était considérablement réduit dans le surnageant par rapport au WT (P <0, 05; Fig. 4b). Le test ELISA a en outre corroboré les niveaux fortement réduits de Gln175His et l'incapacité de Arg177 * et Trp188 * à atteindre l'espace extracellulaire (Fig. 4c, d).

a, b Western blot montre les niveaux de protéines intra- et extracellulaires de ANGPTL7 de type sauvage (WT), Gln175His, Arg177 * et Trp188 *. c ELISA a été exécuté pour quantifier les niveaux de protéines intra- et extracellulaires de ANGPTL7 WT, Gln175His, Arg177 * et Trp188 * transfectés de manière transitoire dans des cellules HEK293 (le lysat de cellules entières a été dilué au 1: 1 000; le surnageant a été dilué au 1: 10 000. Le lysat de cellules entières et le surnageant ont été normalisés par rapport à la quantité totale de protéines de la cellule entière lysat); ****= P < 1 × 10–4 différence statistique par rapport au lysat de cellules entières WT ; ^ = P < 0,05, ^^^ = P < 1 × 10–4 différence statistique par rapport au surnageant WT. d Rapport entre les niveaux de protéines ANGPTL7 WT, Gln175His, Arg177 * et Trp188 * sécrétées par rapport aux intracellulaires. Les niveaux de protéines brutes ANGPTL7 WT, Gln175His, Arg177 * et Trp188 * ont été normalisés à la concentration en protéines du lysat entier; **** = P < 1 × 10-4 différence statistique par rapport à WT. Western blot et analyse ELISA ont été répétés sur trois réplicats biologiques indépendants. Des répliques techniques (n = 3) ont été exécutées pour l'analyse ELISA. Les valeurs P ont été calculées par ANOVA unidirectionnelle avec l'analyse post hoc de Tukey. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne et les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne (SEM). Marqueur de poids moléculaire MWt.

Pour identifier l'expression d'ANGPTL7 dans les tissus oculaires de différentes espèces, des profils de transcriptome de différentes parties de l'œil ont été générés (méthodes supplémentaires). Une expression élevée d'ANGPTL7 a été observée dans la cornée, la TM et la sclérotique chez les humains et les yeux de singe vert d'Afrique (Fig. 5a, b, Fig. 6 supplémentaire). Une expression élevée d'Angptl7 a également été observée dans la cornée, la TM, la sclérotique, la tête du nerf optique et la choroïde / RPE dans les yeux de souris C57BL / 6 J (Fig. 5c). L'hybridation in situ sur un donneur humain et des yeux de souris à l'aide de sondes RNAscope pour ANGPTL7 humain et Angptl7 de souris a montré l'expression de ANGPTL7 / Angptl7 dans la TM, le stroma cornéen et la sclérotique (Fig. 5d, e; Méthodes supplémentaires).

Les niveaux d'expression basés sur le séquençage de l'ARN (mesurés en transcrits par million, TPM, et représentés sous forme de médiane et d'intervalle interquartile) sont les plus élevés dans la cornée, le maillage trabéculaire (TM) et la sclère chez l'homme (a) et le singe vert d'Afrique (b), et dans la cornée, la TM, la sclérotique, la tête du nerf optique et la choroïde/RPE dans les yeux de souris C57BL/6 J (c) ; L'hybridation in situ (RNAscope) montre l'expression de ANGPTL7/Angptl7 (rouge) dans la TM, la cornée et la sclère dans les yeux humains (d) et murins (e). Les barres d'échelle représentent 100 μm. La coloration DAPI (bleue) contre-colore les noyaux cellulaires. Épithélium pigmenté rétinien RPE, corps ciliaire CB, canal de Schlemm SC, muscle ciliaire CM, chambre antérieure AC, cellule ganglionnaire rétinienne RGC, couche nucléaire interne INL, couche nucléaire externe ONL.

Des études antérieures ont montré que la surexpression d'ANGPTL7 dans les cellules TM entraîne des modifications du dépôt et de la réorganisation de la matrice extracellulaire (ECM)21,22 et que l'ANGPTL7 est augmenté dans l'humeur aqueuse des patients atteints de glaucome22, cependant, le rôle d'ANGPTL7 dans la régulation de la PIO n'est pas clair. Pour étudier cela, nous avons injecté la protéine mAngptl7 chez des souris par voie intravitréenne et intracamérulaire et mesuré la PIO au fil du temps. L'injection intravitréenne d'Angptl7 murin (mAngptl7) chez la souris a entraîné une baisse initiale de la PIO suivie, à partir du jour 4, d'une élévation de la PIO de 4 à 5 mmHg, une augmentation de 22 à 25% par rapport à la valeur initiale, qui a duré jusqu'à la fin de l'expérience au jour 7 (Fig. 6a). De même, l'injection intracamérulaire de mAngptl7 chez la souris a entraîné une chute initiale puis une élévation (de 2 à 5 mmHg) de la PIO, du jour 3 jusqu'à la fin de l'expérience le jour 7 (Fig. 6b). Les souris ayant reçu une injection de véhicule n'ont pas montré d'augmentation de la PIO dans l'une ou l'autre des voies d'administration.

La protéine murine Angptl7 (mAngptl7) a été injectée dans les yeux de souris par voie intravitréenne (a) ou intracamérulaire (b), et la PIO a été mesurée au fil du temps. Après une chute initiale, la PIO est restée élevée pendant plusieurs jours dans les yeux traités au mAngptl7 par rapport aux yeux traités au PBS (CTRL (PBS)). * = P < 0,05 ; ** = P < 0,01 signification statistique par rapport au traitement PBS. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du test t de Student.

Nous avons généré et caractérisé des souris Angptl7–/– (KO). Nous avons confirmé via RNAscope que l'ARNm d'Angptl7 n'était exprimé dans aucun tissu oculaire chez les souris KO alors qu'il était exprimé dans la TM, la cornée et la sclérotique des souris WT (Fig. 7; Méthodes supplémentaires). De plus, l'analyse histologique de l'œil n'a montré aucune différence d'angle oculaire chez les souris KO par rapport aux souris WT (Fig. 7 supplémentaire). Nous n'avons observé aucun changement oculaire sur la tomographie par cohérence optique du segment antérieur, ni de différence d'épaisseur cornéenne entre les deux génotypes (Fig. 8 supplémentaire). Nous avons également surveillé la PIO chez les souris KO, Angptl+/- (Het) et WT et observé une diminution dose-dépendante de la PIO pour les trois génotypes (Fig. 8a). La PIO moyenne a été abaissée chez les souris KO (moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) : 15,39 ± 0,25 mmHg) de 11 % (1,96 mmHg, P < 1 × 10–4) par rapport à WT (17,36 ± 0,23 mmHg). Les souris Het (16, 26 ± 0, 43 mm Hg) ont montré une réduction plus faible (6%, 1, 1 mm Hg, P = 0, 02) mais significative de la PIO par rapport au WT.

L'ARNm d'Angptl7 n'était exprimé dans aucun tissu oculaire chez les souris Angptl7 KO alors qu'il était exprimé dans la TM, la cornée et la sclérotique des souris WT, comme le montre l'hybridation in situ (RNAscope). Images en fond clair montrant les sondes suivantes. a Témoin négatif : DapB. b Contrôle positif : Ubc (rouge). c Souris WT : Angptl7 (rouge) et (d) Souris Angptl7 KO : Angptl7 (pas de signal). Les barres d'échelle représentent 100 μm.

a La PIO était significativement réduite chez les souris Angptl7 KO par rapport aux souris Het et WT (moyenne ± SEM ; **** = P < 1 × 10–4). b Comparaison de l'installation de sortie conventionnelle (C) entre les souris KO et WT. Chez les souris KO (n = 7), C a été augmenté par rapport aux souris WT (n = 4, P = 0, 16, test t de Student non apparié). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. c L'injection intravitréenne de 15 µg d'Angptl7-siARN a considérablement réduit la PIO dans deux des six siARN testés (n = 6–8/groupe) par rapport aux groupes PBS (n = 6) et Naïf (pas d'injection, n = 5) et est restée abaissée tout au long de la fin de l'étude. Les siARN 3 et 5 ont abaissé la PIO entre 2 et 4 mmHg à partir de la semaine 2 par rapport aux souris traitées au PBS. * = P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 1 × 10−3, **** = P < 1 × 10−4 différence statistique entre la PIO moyenne pour l'ARNsi #5 et le traitement PBS.# = P < 0,05,## = P < 0,01, ### = P < 1 × 10−3, #### = P < 1 × 10−4 différence statistique entre la moyenne I OP pour siRNA #3 et traitement PBS. d Les résultats de la qPCR de l'anneau limbique micro-disséqué ont montré le plus haut niveau d'inactivation (> 50%) de l'ARNm d'Angptl7 avec les siARN # 3 et # 5 par rapport aux souris traitées au PBS, ce qui est très cohérent avec la baisse de la PIO observée chez les souris injectées avec ces deux siARN ( b ). Les données sont présentées sous forme de moyenne et les barres d'erreur représentent SEM.

Angptl7 est fortement exprimé dans la cornée et la TM et puisque nous avons utilisé un tonomètre à rebond Tonolab pour mesurer la PIO, nous voulions confirmer davantage que la fonction Angptl7 dans la cornée n'affectait pas la PIO. Par conséquent, nous avons mesuré l'installation de sortie conventionnelle en utilisant une perfusion à débit constant pour comprendre la relation entre la PIO et la résistance à la sortie chez les souris Angptl7 KO (n = 7) et WT (n = 4). La facilité d'écoulement conventionnelle a été augmentée de 21% chez KO (25, 18 nL / minute / mmHg) par rapport aux souris WT (20, 85 nL / minute / mmHg; P = 0, 15; Fig. 8b). L'augmentation moyenne de la facilité d'écoulement était cohérente avec la baisse moyenne de la PIO en KO, selon l'équation de Goldman modifiée.

Pour déterminer si l'inactivation d'Angptl7 avec des siARN peut également réduire la PIO, nous avons testé six siARN différents (tableau 2) ciblant Angptl7 chez des souris C57BL/6 J et surveillé la PIO au fil du temps. Nous avons injecté à des souris C57BL/6 J par voie intravitréenne 15 µg d'ARNsi et effectué une qPCR six semaines plus tard sur des anneaux limbiques disséqués à partir d'yeux de souris enrichis en TM. La PIO a été significativement réduite deux semaines après l'injection chez les souris traitées avec deux des six siRNA (siRNA #3 et #5) par rapport aux groupes PBS et Naïve (sans injection) (Fig. 8c, Données supplémentaires 1). Les animaux naïfs et traités au PBS ont maintenu leur PIO au départ pendant toute la durée de l'étude (semaines 0 à 6). Chez les souris traitées avec les siRNA # 3 et # 5, la PIO a été abaissée de 2 à 4 mmHg à partir de la semaine 2 par rapport aux souris traitées au PBS (Fig. 8c). À la fin de l'étude, nous avons prélevé les yeux, soigneusement micro-disséqué l'anneau limbique et effectué la qPCR. Nous avons observé le plus haut niveau d'inactivation (> 50%) de l'ARNm d'Angptl7 avec les siARN n ° 3 et n ° 5 par rapport aux souris traitées au PBS (Fig. 8d), ce qui est cohérent avec la baisse de la PIO observée chez les souris injectées avec ces deux ARNsi. Ces résultats suggèrent qu'une inhibition aiguë de l'expression d'Angptl7 abaisse également la PIO.

Dans cette étude, nous présentons des preuves génétiques et fonctionnelles d'un rôle pour ANGPTL7 dans le contrôle physiologique de la PIO et comme cible potentielle pour le traitement du glaucome. Une publication récente de Tanigawa et al.19 a identifié une association protectrice d'ANGPTL7 avec le glaucome et dans cet article, nous évaluons et renforçons cette découverte en (1) ajoutant six cohortes aux analyses d'association génétique dans UK Biobank et FinnGen qui ont été utilisées dans Tanigawa et al, et montrant une tendance protectrice constante dans la majorité d'entre elles pour la variante faux-sens rare, Gln175His (rs28991009); (2) identifier une variante pLOF enrichie d'ascendance africaine, Trp188 *, dans ANGPTL7 en plus de Arg177 * chez les Européens et montrer que les deux variantes tendent vers la protection contre le glaucome (3) identifier par séquençage de l'exome et analyse de la charge génétique plusieurs variantes ANGPTL7 délétères prédites associées à une PIO réduite, indiquant qu'il peut y avoir d'autres variantes ANGPTL7 ultra-rares qui confèrent une protection contre le glaucome. Ensemble, ces nouvelles analyses apportent un soutien supplémentaire au rôle d'ANGPTL7 dans la régulation de la PIO et la pathogenèse du glaucome. Nous montrons également, grâce à des tests d'expression cellulaire, que Gln175His, Arg177 * et Trp188 * étaient sévèrement déficients en sécrétion par rapport au type sauvage et, bien qu'il ne s'agisse pas d'une preuve, cette observation est cohérente avec l'hypothèse selon laquelle les trois variantes entraînent une perte de fonction protéique.

ANGPTL7 est une glycoprotéine sécrétée dont on pense qu'elle forme des homo-oligomères (tri- ou tétramères), comme les autres membres de la famille ANGPTL23,24. L'ARNm ANGPTL7 a d'abord été isolé à partir d'yeux post-mortem humains où il montre l'expression la plus élevée par rapport aux autres tissus23. Dans l'œil, nos résultats d'hybridation in situ montrent que ANGPTL7 est exprimé le plus fortement dans la cornée et la TM, conformément aux résultats précédents22. Nous avons également montré en utilisant le RNAseq unicellulaire que l'expression d'ANGPTL7 est particulièrement enrichie dans le tissu juxtacanaliculaire (JCT), une région de la TM la plus importante pour la régulation de la PIO et la génération de la résistance à l'écoulement de l'humeur aqueuse25,26. En plus d'être exprimé dans les tissus directement concernés par le glaucome, plusieurs sources de données ont impliqué ANGPTL7 dans la physiopathologie du glaucome. Premièrement, des niveaux élevés d'ARNm et de protéines ANGPTL7 ont été observés dans les tissus oculaires de patients atteints de glaucome par rapport aux témoins, et dans des conditions d'augmentation de la PIO simulée par la perfusion d'explants du segment antérieur de l'œil22,27,28. Deuxièmement, ANGPTL7 est l'un des gènes les plus régulés positivement en réponse au traitement aux corticostéroïdes29,30, ce qui peut entraîner une augmentation de la PIO chez environ 40 % de la population générale et environ 90 % des personnes atteintes de GPAO31,32. Troisièmement, les niveaux d'ANGPTL7 sont également augmentés en réponse au TGF-bêta, un facteur de croissance censé moduler l'ECM et entraîner une augmentation de la PIO33. Quatrièmement, ANGPTL7 lui-même peut moduler l'expression des composants de la TM ECM21,22.

Les études ci-dessus suggèrent une forte corrélation entre l'expression d'ANGPTL7 et l'état pathologique du glaucome, cependant, elles ne prouvent pas une relation causale entre les niveaux d'ANGPTL7 et une PIO/glaucome élevée. La découverte génétique humaine d'une association entre la perte d'ANGPTL7 et une PIO inférieure suggère que ANGPTL7 est physiologiquement important pour la régulation de la PIO. Nous avons validé cette hypothèse chez des souris où nous avons effectué des expériences réciproques : mesurer la PIO après avoir augmenté les niveaux d'ANGPTL7 via l'injection de mAngptl7 dans les yeux de souris, et après avoir retiré toutes les protéines mAngptl7 en générant des souris Angtpl7 KO. Nos résultats montrent que l'augmentation de mAngptl7 entraîne une augmentation de la PIO (~ 2 à 4 mmHg) et que la diminution de mAngptl7 chez les souris KO réduit les niveaux basaux de PIO (~ 2 mmHg). Nous avons également observé une tendance à l'augmentation de la facilité de sortie conventionnelle (~ 21%) chez les souris KO par rapport aux souris WT, ce qui était cohérent avec la diminution de la PIO chez les souris KO. Ensemble, ces résultats suggèrent que ANGPTL7 fonctionne in vivo pour maintenir l'homéostasie de la PIO. Nous avons en outre récapitulé la réduction de la PIO observée chez les souris KO en injectant dans les yeux de souris WT des siARN contre Angptl7, ce qui non seulement reproduit l'observation chez les souris mutantes génétiques, mais illustre également que l'effet de mAngptl7 sur la PIO se poursuit après le développement et peut être modulé par la thérapeutique à l'âge adulte. Nos résultats de PIO inférieure chez les souris Angptl7 KO sont très cohérents avec les observations de la génétique humaine. Sur cette base, nous pourrions étendre les résultats de l'inactivation de l'ARNsi aux humains et supposer que l'inhibition d'ANGPTL7 à l'âge adulte pourrait être une stratégie efficace pour réduire la PIO et, éventuellement, le risque de glaucome.

Nos résultats en génétique humaine indiquent que les variantes de l'ANGPTL7 associées à une PIO réduite étaient également associées à une diminution du facteur de résistance cornéen moyen (CRF), une sortie de l'analyseur de réponse oculaire qui reflète la propriété élastique de la cornée34 et à une augmentation de la puissance de réfraction cornéenne moyenne (mCRP). La mCRP, ainsi que la longueur axiale et la puissance de la lentille, contribuent à l'état de réfraction global de l'œil35, et une augmentation de la mCRP (c'est-à-dire une cornée plus raide) peut indiquer une myopie ou un astigmatisme possible. Cependant, comme nous n'avons pas observé de preuves d'association avec la myopie ou l'astigmatisme dans PheWAS, nous concluons que les modifications de la mCRP sont soit insuffisantes pour entraîner un résultat de la maladie, soit compensées par d'autres modifications de traits qui n'ont pas été mesurés, comme la longueur axiale36. Bien qu'un effet d'ANGPTL7 sur les propriétés cornéennes soit clairement indiqué par les associations avec mCRP et CRF, nous affirmons que cet effet ne peut pas expliquer l'étendue complète de la réduction de la PIO observée. Au lieu de cela, nous postulons une contribution indépendante d'ANGPTL7 à l'homéostasie de la PIO basée sur les éléments suivants : (1) l'association persistante avec une IOPcc réduite suggère qu'il existe une réduction de la PIO même après avoir contrôlé les propriétés cornéennes ; (2) les yeux des souris Angptl7 KO présentent une PIO basale réduite sans signe d'amincissement cornéen ou d'autres anomalies cornéennes ; et (3) l'association des variantes d'ANGPTL7 avec la protection contre le glaucome est un résultat auquel nous ne nous attendrions pas si la réduction de la PIO était purement due à l'effet d'ANGPTL7 sur l'anatomie cornéenne37. Par conséquent, nous pensons que ANGPTL7 a probablement un effet pléiotrope à la fois sur la PIO et sur l'anatomie/biomécanique de la cornée chez l'homme.

L'inactivation thérapeutique d'ANGPTL7 chez les patients atteints de glaucome à angle ouvert peut présenter une opportunité unique non seulement de réduire la PIO grâce à un nouveau mécanisme d'action, mais également d'intervenir dans le processus de la maladie. Parmi les agents abaissant la PIO les plus largement utilisés, aucun ne traite directement les changements physiopathologiques se produisant au niveau de la TM et réduit plutôt la PIO par des mécanismes qui réduisent la charge aqueuse sur la voie conventionnelle, soit en supprimant la formation aqueuse, soit en augmentant son écoulement via la voie alternative (uvéosclérale)38. Par conséquent, à mesure que le dysfonctionnement de la MT progresse chez un patient glaucomateux, l'intensification du traitement s'ensuit naturellement18. Alors que d'autres études sont nécessaires pour étudier le rôle d'ANGPTL7 dans les voies contribuant au dysfonctionnement de la TM et à l'élévation de la PIO, plusieurs éléments de preuve indiquent des actions pro-fibrotiques au niveau de la TM, y compris sa réactivité aux corticostéroïdes et au TGF-bêta, ainsi que son expression enrichie dans JCT TM (discuté précédemment).

Comme toutes les études, cette étude comporte des limites. Premièrement, nous n'avons pas pris en compte l'utilisation de médicaments abaissant la PIO dans l'analyse de la PIO. Nous avons exclu de l'analyse de la PIO les personnes ayant un diagnostic de glaucome, ce qui réduit considérablement l'effet de l'utilisation de médicaments, mais cela n'exclurait pas les personnes prenant des médicaments abaissant la PIO sans diagnostic de glaucome. De plus, la mesure de la PIO dans UKB pour la plupart des participants n'a été prise qu'une seule fois et peut donc être sujette à des erreurs contre lesquelles une médiane de plusieurs mesures pourrait se protéger. Les deux facteurs ci-dessus influenceraient l'estimation de l'effet des variants génétiques rares sur la PIO. Deuxièmement, étant donné qu'un diagnostic de glaucome peut souvent être posé bien après le début de la maladie, nous pouvons nous attendre à ce qu'un certain pourcentage de témoins aient un glaucome non diagnostiqué, ce qui peut affecter l'estimation de la taille de l'effet. Troisièmement, le gène ANGPTL7 chez l'homme se trouve dans l'intron 28 de MTOR39, par conséquent, des variantes de ANGPTL7 pourraient également affecter la fonction de MTOR. Bien qu'il s'agisse d'une possibilité, il est peu probable que l'effet sur la PIO et le glaucome soit dû à MTOR, car : (i) les variantes devraient modifier les protéines dans ANGPTL7 alors qu'il n'y a pas d'effet fonctionnel prédit évident sur MTOR ; (ii) nous montrons des données suggérant que les variantes ont un impact fonctionnel sur ANGPTL7 ; et (iii) nous montrons des données de souris qui établissent un rôle pour ANGPTL7 dans la régulation de la PIO.

En résumé, nos résultats génétiques et pharmacologiques indiquent que ANGPTL7 participe à la régulation physiologique normale de la PIO chez l'homme et la souris. Étant donné que des quantités excessives de protéine mAngptl7 dans les yeux des animaux de laboratoire provoquent une élévation de la PIO à des niveaux pathologiques, la régulation à la hausse de ANGPTL7 chez l'homme peut être responsable de la PIO élevée qui conduit au GPAO. Par conséquent, nous proposons ANGPTL7 comme un excellent candidat à explorer comme cible thérapeutique pour le GPAO.

Tous les participants ont donné leur consentement éclairé et les études ont été approuvées par les IRB individuels des institutions respectives. UK Biobank a l'approbation du North West Multi-center Research Ethics Committee (MREC), qui couvre le Royaume-Uni. Il a également demandé l'approbation en Angleterre et au Pays de Galles du Patient Information Advisory Group (PIAG) pour avoir accès à des informations qui lui permettraient d'inviter des personnes à participer. L'étude DiscovEHR a été approuvée par l'Institutional Review Board (IRB) de Geisinger. La biobanque BioMe est un biodépôt de recherche en cours approuvé par la faculté de médecine Icahn de l'IRB du mont Sinaï. Le comité d'éthique de l'Université de Lund a approuvé l'étude Malmo Diet and Cancer Study (LU 51–90) et tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit. L'étude du CGPS (H-KF-01-144/01) a été approuvée par le comité d'éthique de la région de la capitale et par l'agence danoise de protection des données. La recherche à la Biobanque estonienne est réglementée par la loi sur la recherche génétique humaine et tous les participants ont signé un large consentement éclairé. L'approbation de l'IRB pour l'étude en cours a été accordée par le comité d'éthique de la recherche de l'Université de Tartu, approbation n° 236/T-23. Pour l'étude POAAGG, l'approbation d'inscription et de recontact des sujets a été obtenue auprès de l'IRB de l'Université de Pennsylvanie. La biobanque de Finngen a été évaluée et approuvée par le comité d'éthique de coordination du district hospitalier d'Helsinki et d'Uusimaa.

L'association avec la PIO a été testée sur un total de 101 678 personnes et 27 529 personnes d'ascendance européenne de la United Kingdom Biobank (UKB) et de la cohorte MyCode Community Health Initiative de Geisinger Health System (GHS), respectivement. L'UKB est une étude de cohorte basée sur la population de personnes âgées de 40 à 69 ans recrutées dans 22 centres de dépistage au Royaume-Uni entre 2006 et 201040. L'étude GHS MyCode est une cohorte basée sur le système de santé de patients du centre et de l'est de la Pennsylvanie (États-Unis) recrutés entre 2007 et 201941. Pour les tests d'association de la PIO chez les personnes d'ascendance africaine, nous avons inclus 4114 personnes de l'UKB et 3167 personnes de l'étude Primary Open Angle African-American Glaucoma Genetics (POAAGG) menée à l'Université de Pennsylvanie Perelman School of Medicine42. Nous avons exclu tous les participants avec un code de diagnostic de glaucome (ICD-10 H40) ou un glaucome autodéclaré (identifiants de champ UKB : 6148 et 20002) des analyses de la PIO.

L'association des variants ANGPTL7 avec le glaucome a été testée dans 8 études : UKB, GHS, Mt. Sinai BioMe cohort (SINAI), Malmö Diet and Cancer study (MALMO)43, Estonia Biobank (EstBB)44, The Trøndelag Heath Study (HUNT)45, FinnGen, une étude finlandaise, Copenhagen General Population Study et Copenhagen City Heart Study (CGPS-CCHS)46. Nous avons eu, au total, jusqu'à 40 042 cas (UKB : 12 377, GHS : 8032, SINAI : 409, MALMO : 2395, EstBB : 7629, HUNT : 3874 ; CPGS-CCHS : 1863 ; FinnGen : 3463) et 947 782 témoins d'ascendance européenne, et 5153 cas (UK B : 448, POAAGG : 3444, SINAI : 1261) et 21 650 témoins d'ascendance africaine dans les analyses de glaucome.

La PIO dans l'UKB a été mesurée dans chaque œil à l'aide de l'analyseur de réponse oculaire (Reichert Corp., Buffalo, New York). Les participants ont été exclus de ce test s'ils ont déclaré avoir subi une chirurgie oculaire au cours des 4 semaines précédentes ou avoir eu une infection oculaire. L'analyseur de réponse oculaire calcule deux formes de PIO, une PIO corrélée de Goldmann (IOPg) et une PIO compensée par la cornée (IOPcc). L'IOPg se rapproche le plus de la PIO mesurée par le tonomètre à aplanation Goldmann (GAT), qui a été l'étalon-or pour mesurer la PIO, tandis que l'IOPcc fournit une mesure de la PIO qui est ajustée pour éliminer l'influence de la biomécanique cornéenne47. Pour cette étude, nous nous sommes concentrés sur la PIOg car cette mesure est la plus comparable aux mesures de la PIO dans d'autres cohortes, et ici la PIOg sera appelée PIO. La PIO dans POAAGG a été mesurée à l'aide d'un GAT. Dans le GHS, les mesures de la PIO ont été obtenues à partir de plusieurs instruments, dont GAT, Tono-pen et I-Care, qui sont corrélés avec les lectures de la PIOg de l'Ocular Response Analyzer48. Pour les personnes GHS à qui aucun médicament de PIO n'a été prescrit, nous avons utilisé la médiane de toutes les mesures de PIO disponibles. Pour les personnes qui se sont fait prescrire un médicament pour la PIO, nous avons utilisé la médiane des mesures de la PIO disponibles avant la date de début des médicaments pour la PIO (le cas échéant). Les personnes pour lesquelles nous n'avions pas de valeurs de PIO non médicamenteuses ont été exclues des analyses génétiques de la PIO. Pour les analyses d'association de la PIO, nous avons exclu les personnes ayant : (1) un diagnostic de glaucome ; (2) mesures de la PIO qui étaient à plus de 5 écarts-types de la moyenne ; (3) plus d'une différence de 10 mmHg entre les deux yeux. Nous avons dérivé une mesure moyenne de la PIO entre les deux yeux pour chaque individu. La PIO d'un seul œil a été utilisée dans les cas où les mesures de la PIO pour les deux yeux n'étaient pas disponibles.

Des détails sur la définition du glaucome dans chaque cohorte sont donnés dans les méthodes supplémentaires. En bref, les cas de glaucome dans GHS, SINAI, MALMO, HUNT, EstBB, FinnGen (v.R3) et CGPS-CCHS ont été définis par la présence d'un code de diagnostic ICD-10 H40 dans les dossiers de santé électroniques des patients externes ou hospitalisés. Dans UKB, les cas de glaucome ont été définis comme des individus avec un diagnostic CIM-10 H40 ou un glaucome autodéclaré (ID de champ UKB : 6148 ou 20002). Dans la cohorte POAAGG, les cas de glaucome et les témoins ont été classés sur la base d'un examen ophtalmologique par des spécialistes du glaucome, et les suspects de glaucome ont également été inclus dans les cas42.

Le séquençage et le génotypage de l'exome entier à couverture élevée ont été effectués au Regeneron Genetics Center49,50, comme décrit dans les méthodes supplémentaires. Nous avons estimé l'association avec la PIO et le glaucome des variants génétiques ou leur charge génétique à l'aide de REGENIE v1.0.4351 (UKB, GHS, MALMO, SINAI), SAIGE52 (HUNT, EstBB, FinnGen) ou de la régression logistique (CGPS-CCHS). Les analyses ont été ajustées pour l'âge, l'âge2, le sexe, un terme d'interaction âge-sexe, les covariables expérimentales liées aux lots et les principales composantes génétiques, le cas échéant. Les détails de l'analyse statistique spécifique à la cohorte sont fournis dans les méthodes supplémentaires. Les résultats des cohortes ont été regroupés à l'aide d'une méta-analyse pondérée en variance inverse. Des détails sur l'analyse PheWAS effectuée dans UKB et GHS sont fournis dans les méthodes supplémentaires. Les analyses Western blot et ELISA ont été répétées sur trois réplicats biologiques indépendants et les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Des répliques techniques (n = 3) ont été exécutées pour l'analyse ELISA. Les valeurs P ont été calculées par ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Tukey pour l'analyse de plusieurs groupes (données supplémentaires 1). Un total de 12 yeux ont été utilisés pour tester l'effet de l'augmentation des niveaux de mAngptl7 dans les yeux de souris et le test t de Student a été utilisé pour calculer la signification du changement résultant de la PIO. La PIO a été mesurée sur 33 souris WT, 41 souris Angptl7 KO et 15 souris Angptl7 Het et la facilité d'écoulement conventionnelle a été mesurée sur 4 souris WT et 7 souris Angptl7 KO. Le test t de Student non apparié a été utilisé pour calculer la signification statistique des résultats entre les différents génotypes. Pour l'inactivation in vivo des siRNA de mAngptl7, nous avons utilisé 8, 6, 6 et 5 yeux de souris pour les siRNA # 3, siRNA # 5, traités au PBS et témoins naïfs, respectivement. La signification statistique a été calculée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec l'analyse post hoc de Dunnett (données supplémentaires 1).

Les cellules HEK293, dérivées de Regeneron, ont été cultivées dans un milieu DMEM 4,5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (–) Phosphate de Sodium, (–) Pyruvate de Sodium additionné de 10 % de FBS et 1 % de Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (Invitrogen), à 37 °C dans une atmosphère humidifiée sous 5 % de CO2. La veille de la transfection, les cellules HEK293 ont été ensemencées dans OptiMEM additionné de 10% de FBS. Après 24 h, les cellules ont été transfectées avec FuGENE 6 et 10 µg de pcDNA 3.1(+) codant pour les protéines suivantes : ANGPTL7 WT, Gln175His, Arg177* et Trp188*. Après 24h, le support a été changé avec 2% de FBS OptiMEM. Le lendemain, les cellules ont été collectées dans du tampon RIPA, additionné d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase (BRAND) ou de réactif TRIzol (Invitrogen) pour l'analyse des protéines et de l'ARN, respectivement. Les surnageants ont été transférés dans un tube Eppendorf et immédiatement congelés pour une analyse protéique en aval. L'analyse Western blot a été réalisée en utilisant un anticorps polyclonal de lapin contre ANGPTL7 à une dilution de 1:1000 (10396-1-AP ProteinTech), en utilisant des procédures standard. ANGPTL7 a été quantifié par ELISA conformément aux instructions du fabricant (LS-F50425 Life Sciences). Les lysats cellulaires ont été dilués au 1:1000. Les surnageants ont été dilués au 1:10 000. La plaque ELISA a été lue à 450 nm via le lecteur de plaque SpectraMax M4 (Molecular Devices).

L'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen) et du kit RNeasy (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant et traité avec de la DNase I sans RNase (Promega). L'ADNc a été synthétisé à l'aide du kit de synthèse d'ADNc Superscript VILO (Invitrogen). L'analyse Taqman a été réalisée à l'aide de TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) dans un QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystems) et d'amorces et de sondes disponibles dans le commerce pour ANGPTL7 (Hs00221727—Applied Biosystems) et GAPDH (Hs02786624_g1—Applied Biosystems).

Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux conformément au Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de Regeneron (IACUC) et à la déclaration de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) pour l'utilisation d'animaux en recherche ophtalmique et visuelle. Des souris Angptl7–/–, sur fond 63 % C57BL/6NTac et 37 % 129SvEvTac, ont été générées par Regeneron Pharmaceuticals à l'aide de la technologie VelociMouse®53. Des souris hétérozygotes (Angptl7+/-) ont été élevées pour générer des compagnons de litière de type sauvage, het et KO appariés selon l'âge qui ont été utilisés pour l'expérimentation à l'âge de 3-4 mois (genre mixte). L'anatomie oculaire de ces souris a été caractérisée par tomographie par cohérence optique. Des méthodes détaillées sur la génération et la caractérisation des souris KO sont fournies dans les méthodes supplémentaires. Pour les expériences d'ARNsi in vivo, nous avons utilisé des souris mâles C57BL/6 J, âgées de 3 à 4 mois, de Jackson Labs.

Les souris ont été anesthésiées et la PIO a été mesurée dans les deux yeux à l'aide d'un tonomètre à rebond TonoLab (Colonial Medical Supply, Franconia, NH) avant le début de l'injection d'Angptl7 et tous les jours ensuite pendant six jours54,55,56. Lors du test des siARN Angptl7, les PIO ont été mesurées dans chaque œil avant le début de l'expérience, puis chaque semaine jusqu'à la fin de l'étude. Les mesures de la PIO pour les deux yeux ont été réalisées en 3 à 5 min. Six mesures simples correctes ont été effectuées sur chaque œil pour générer une lecture de la PIO. Nous avons pris cinq lectures de PIO pour chaque œil et utilisé la moyenne de ces lectures à chaque instant.

La facilité d'écoulement de l'humeur aqueuse (C) a été mesurée en utilisant notre technique de perfusion à débit constant chez des souris vivantes55,56,57,58. Les souris ont été anesthésiées en utilisant un cocktail kétamine/xylazine 100/10 mg/kg. Un quart à la moitié de cette dose a été administrée pour le maintien de l'anesthésie si nécessaire. Une à deux gouttes de proparacaïne HCl (0,5%) (Bausch + Lomb) ont été appliquées localement sur les deux yeux pour une anesthésie cornéenne. Les chambres antérieures des deux yeux ont été canulées à l'aide d'une aiguille de calibre 30 insérée à travers la cornée de 1 à 2 mm en avant du limbe et poussée à travers la chambre antérieure jusqu'à un point de l'angle de la chambre opposé au point de canulation, en prenant soin de ne pas toucher l'iris, l'épithélium de la capsule du cristallin antérieur ou l'endothélium cornéen. Chaque aiguille de canulation a été connectée à un transducteur de pression BLPR-2 (World Precision Instruments [WPI], Sarasota, FL, USA) préalablement calibré (sphygmomanomètre, Diagnostix 700 ; American Diagnostic Corporation, Hauppauge, NY, États-Unis) pour une détermination continue de la pression dans le système de perfusion. Une goutte de Genteal (Alcon) a également été administrée à chaque œil pour éviter le dessèchement de la cornée. Les extrémités opposées du transducteur de pression ont été connectées via un autre tube à une seringue de 1 ml chargée dans une pompe à perfusion de microdialyse (SP200I Syringe Pump; WPI). Le tube, le transducteur et la seringue ont tous été remplis de DPBS stérile (Gibco). Les signaux de chaque transducteur de pression ont été transmis via un amplificateur de pont TBM4M (WPI) et un convertisseur analogique-numérique Lab-Trax (WPI) à un ordinateur pour affichage sur un enregistreur graphique virtuel (logiciel LabScribe2 ; WPI). Les yeux ont été initialement perfusés à un débit de 0,1 μl/min. Lorsque les pressions se sont stabilisées en 10 à 30 min, les mesures de pression ont été enregistrées sur une période de 5 min, puis les débits ont été augmentés séquentiellement à 0,2, 0,3, 0,4 et 0,5 μl/min. Trois pressions stabilisées à des intervalles de 3 minutes à chaque débit ont été enregistrées. La C dans chaque œil de chaque animal a été calculée comme l'inverse de la pente d'un tracé de la pression stabilisée moyenne en ordonnée par rapport au débit en abscisse.

Une aiguille de calibre 33 avec une microseringue en verre (volume de 5 µL ; Hamilton Company) a été utilisée pour des injections de protéine/ARNsi Angptl7 dans les yeux de souris. Pour les injections intravitréennes, l'œil a été proptosé et l'aiguille a été insérée à travers la sclère équatoriale et dans la chambre vitrée à un angle d'environ 45 degrés, en prenant soin d'éviter de toucher la partie postérieure du cristallin ou la rétine. La protéine Angptl7 (catalogue # 4960-AN-025; R&D Systems, Minneapolis, MN) ou siRNA (d'Alnylam Pharmaceuticals, Supplementary Methods) ou PBS (1uL) a été injecté dans le vitré en 1 minute. L'aiguille a ensuite été laissée en place pendant encore 45 s (pour faciliter le mélange), avant d'être rapidement retirée. Les séquences d'ARNsi pour les six sondes testées sont fournies dans le tableau 2. Avant et pendant les injections intracamérulaires de la protéine Angptl7, les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane (2,5 %) contenant de l'oxygène (0,8 L/min). Pour l'anesthésie topique, les deux yeux ont reçu une à deux gouttes de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % (Akorn Inc.). Chaque œil a été proptosé et l'aiguille a été insérée à travers la cornée juste au-dessus de la région limbique et dans la chambre antérieure à un angle parallèle à la cornée, en prenant soin d'éviter de toucher l'iris, l'épithélium de la capsule du cristallin antérieur ou l'endothélium cornéen. Jusqu'à 1 µL de protéine Angptl7 ou de PBS a été injecté dans chaque œil sur une période de 30 secondes avant le retrait de l'aiguille. Une seule injection a été administrée au jour 0.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources sous-jacentes aux figures principales sont fournies dans les données supplémentaires 1. Des images non recadrées et non éditées des taches qui apparaissent dans l'article principal sont fournies dans les données supplémentaires 2. Tout le séquençage de l'exome entier, la puce de génotypage et la séquence imputée décrits dans ce rapport sont accessibles au public. chercheurs enregistrés via le protocole d'accès aux données de la biobanque britannique. Des informations supplémentaires sur l'enregistrement pour l'accès aux données sont disponibles sur http://www.ukbiobank.ac.uk/register-apply/. De plus amples informations sur la séquence complète de l'exome sont disponibles sur https://www.ukbiobank.ac.uk/media/kqjmdwfg/access_064-uk-biobank-exome-release-faq_v10.pdf. Des informations détaillées sur la puce et la séquence imputée sont disponibles sur : https://www.ukbiobank.ac.uk/media/cffi4mx5/ukb-genotyping-and-imputation-data-release-faq-v3-2-1.pdf. Les données de séquençage et de génotypage des exomes de DiscovEHR et de l'Université de Pennsylvanie peuvent être mises à la disposition des chercheurs qualifiés, universitaires et non commerciaux sur demande via un accord de transfert de données avec Geisinger Health System et l'Université de Pennsylvanie, respectivement. Les données génétiques des cohortes HUNT, CGPS-CCHS et Estonie peuvent être mises à disposition en contactant les institutions respectives. Les données FinnGen R3 sont accessibles sur : https://www.finngen.fi/. Les matériaux Regeneron décrits dans ce manuscrit peuvent être mis à la disposition des chercheurs universitaires qualifiés sur demande via notre portail (https://regeneron.envisionpharma.com/vt_regeneron/). Dans certaines circonstances où nous ne sommes pas en mesure de fournir un réactif propriétaire particulier, une molécule alternative peut être fournie qui se comporte de manière similaire. Des informations supplémentaires sur la façon dont nous partageons nos matériaux peuvent être obtenues en contactant l'adresse e-mail des collaborations précliniques de Regeneron ([email protected]).

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Nous tenons à remercier tous ceux qui ont rendu ce travail possible. En particulier : l'équipe de UK Biobank, leurs bailleurs de fonds, les professionnels dévoués des institutions membres qui ont contribué et soutenu ce travail, et plus particulièrement les participants de UK Biobank, sans qui cette recherche ne serait pas possible. Le séquençage de l'exome a été financé par le UK Biobank Exome Sequencing Consortium (c'est-à-dire Bristol Myers Squibb, Regeneron, Biogen, Takeda, AbbVie, Alnylam, AstraZeneca et Pfizer). Cette recherche a été menée à l'aide de la UK Biobank Resource sous le numéro de demande 26041 ; EstBB, nous remercions tous les participants et le personnel de la biobanque estonienne pour leur contribution à cette recherche et le travail analytique d'EstBB a été effectué en partie au Centre de calcul à haute performance de l'Université de Tartu. LM et KK ont été soutenus par des subventions du Conseil estonien de la recherche PRG184 et par l'Union européenne par le biais du Fonds européen de développement régional (projet n° 2014-2020.4.01.15-0012) ; Nous tenons à remercier les participants et les chercheurs de l'étude FinnGen. Nous remercions également les participants à l'Initiative de santé communautaire MyCode d'avoir pris part à la collaboration DiscovEHR. Cette recherche a reçu un financement de Regeneron Pharmaceuticals. JOB a été soutenu par le National Eye Institute (#R01EY023557-01), Vision Research Core Grant (P30 EY001583) et NIH Grant (LM010098). Les fonds proviennent également de la Fondation FM Kirby, de la Recherche pour prévenir la cécité, du Conseil des femmes visiteuses de l'hôpital UPenn et de la Fondation Paul et Evanina Bell Mackall. Le département d'ophtalmologie de la Perelman School of Medicine et du VA Hospital de Philadelphie, en Pennsylvanie, a également apporté son soutien. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. L'étude sur la santé de Trøndelag (l'étude HUNT) est une collaboration entre le centre de recherche HUNT (faculté de médecine et des sciences de la santé, NTNU, université norvégienne des sciences et technologies), le conseil du comté de Trøndelag, l'autorité sanitaire régionale centrale de Norvège et l'institut norvégien de santé publique. Le génotypage dans HUNT a été financé par les National Institutes of Health ; Université du Michigan; le Conseil norvégien de la recherche ; le Comité de liaison pour l'éducation, la recherche et l'innovation en Norvège centrale ; et le Comité mixte de recherche entre l'hôpital St Olav et la Faculté de médecine et des sciences de la santé, NTNU. SS a reçu un financement du Fonds de recherche indépendant du Danemark (responsable de la recherche Sapere Aude, numéro de subvention 9060-00012B). VRMC a reçu un financement de R21EY028273-01A1 et de la bourse de la Fondation Lisa Dean Moseley.

Centre de génétique Regeneron, Tarrytown, NY, 10591, États-Unis

Kavita Praveen, Lauren Gurski, Ariane H. Ayer, Trikaladarshi Persaud, Lawrence Miloscio, Silvio Alessandro Di Gioia, Esteban Chen, Eric Jorgenson, Dadong Li, Alexander Li, Eli Stahl, Dylan Sun, Tanya M. Teslovich, Goncalo R. Abecasis, Michael Cantor, Andrew Deubler, Aris Economides, Jeffrey G. Reid, Alan Shuldiner, Katherine Siminovitch , Christina Beechert, Caitlin Forsythe, Erin D. Fuller, Zhenhua Gu, Michael Lattari, Alexander Lopez, Thomas D. Schleicher, Maria Sotiropoulos Padilla, Louis Widom, Sarah E. Wolf, Manasi Pradhan, Kia Manoochehri, Ricardo H. Ulloa, Xiaodong Bai, Suganthi Balasubra manian, Suying Bao, Boris Boutkov, Siying Chen, Gisu Eom, Lukas Habegger , Alicia Hawes, Shareef Khalid, Olga Krasheninina, Rouel Lanche, Adam J. Mansfield, Evan K. Maxwell, Mona Nafde, Sean O'Keeffe, Max Orelus, Razvan Panea, Tommy Polanco, Ayesha Rasool, William Salerno, Kathie Sun, Amelia Averit, Nilanjana Banerjee, Sameer Malhotra, Deepika Sharma, Jeffery C. Staples, Ashish Yadav, Joshua Backman, Amy Damask, Lee Dobbyn, Manuel Allen Revez Ferreira, Arkopravo Ghosh, Christopher Gillies, Hyun Min Kang, Michael Kessler, Jack Kosmicki, Nan Lin, Daren Liu, Adam Locke, Jonathan Marchini, Anthony Marcketta, Joelle Mba Arden Moscati, Charles Paulding, Carlo Sidore, Kyoko Watanabe, Bin Ye, Blair Zhang, Andrey Ziyatdinov, Michelle G. LeBlanc , Jason Mighty, Lyndon J. Mitnaul, Nirupama Nishtala, Nadia Rana, Marcus B. Jones, Gonzalo R. Abecasis, Michael N. Cantor, Katia Karalis, Aris Economides, Giusy Della Gatta , Manuel A. Ferreira, Aris Baras et Giovanni Coppola

Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY, 10591, États-Unis

Gaurang C. Patel, Matthew D. Still, Tavé Van Zyl, Wen Fury, Brijeshkumar Patel, Jeremy S. Rabinowitz, Sabrina Walley, Hua Yang, Sarthak Zaveri, Ying Hu, Jonathan Weyne, Aris Economides, George D. Yancopoulos et Carmelo Romano

KG Jebsen Center for Genetic Epidemiology, Department of Public Health and Nursing, NTNU, Norwegian University of Science and Technology, 7030, Trondheim, Norvège

Ben Brumpton, Bjørn Olav Åsvold et Kristian Hveem

Centre de recherche HUNT, Département de la santé publique et des soins infirmiers, NTNU, Université norvégienne des sciences et technologies, 7600, Levanger, Norvège

Ben Brumpton, Bjørn Olav Åsvold et Kristian Hveem

Clinique de médecine, Hôpital St. Olavs Hôpital universitaire de Trondheim, 7030, Trondheim, Norvège

Ben Brumpton

Centre estonien de génomique, Institut de génomique, Université de Tartu, Tartu, Estonie

Kristi Krebs, Andres Metspalu, Mari Nelis, Reedik Mägi, Tõnu Esko & Lili Milani

Département d'endocrinologie, Clinique de médecine, Hôpital St. Olavs, Hôpital universitaire de Trondheim, 7030, Trondheim, Norvège

Bjørn Olav Åsvold

Département d'ophtalmologie, Pearlman School of Medicine, Université de Pennsylvanie, Philadelphie, PA, États-Unis

Venkata RM Chavali, Harini V. Gudiseva, Rebecca Salowe et Joan M. O'Brien

Alnylam Pharmaceuticals, Inc, Cambridge, MA, 02142, États-Unis

Sarah Hyde, Stéphanie Lefebvre, James Mclninch & Scott Waldron

Bayer AG, Produits pharmaceutiques, Recherche et développement, 13342, Berlin, Allemagne

Claudia Schurmann

Département de biochimie clinique, Rigshospitalet, Hôpital universitaire de Copenhague, Copenhague, Danemark

Anne-Sofie Seidelin, Anne Tybjærg-Hansen & Stefan Stender

Division de médecine cardiovasculaire, Département de médecine interne, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

Christen Willer

Département de médecine computationnelle et de bioinformatique, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

Christen Willer

Département de génétique humaine, Université du Michigan, Ann Arbor, MI, États-Unis

Christen Willer

Université de Lund, Département des sciences cliniques de Malmö, Malmö, Suède

Olle Melander

Hôpital universitaire de Skåne, Département d'urgence et de médecine interne, Malmö, Suède

Olle Melander

Geisinger, Danville, Pennsylvanie, 17821, États-Unis

Lance J. Adams, Jackie Blank, Dale Bodian, Derek Boris, Adam Buchanan, David J. Carey, Ryan D. Colonie, F. Daniel Davis, Dustin N. Hartzel, Melissa Kelly, H. Lester Kirchner, Joseph B. Leader, David H. Ledbetter, J. Neil Manus, Christa L. Martin, Raghu P. Metpally, Michelle Meyer, Tooraj Mirshahi, Matthew Oetjens, Thomas Nate Person, Christopher Still, Natasha Strande, Amy Sturm, Jen Wagner et Marc Williams

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Tous les auteurs ont contribué à l'examen critique du manuscrit pour le contenu intellectuel important et à l'approbation finale de la soumission du manuscrit pour publication. Conceptualisation : KP, GP, AB, CR et GC Conservation des données : DL, MNC Analyse génétique : KP, LG, MAF, AHA, SADG, AL, TMT, CS, DS, KK, BB, SS, ES, EJ Acquisition de financement : GDY, GRA, AB, JMB, CR, LM, OM, SS, KH Expériences sur souris : GP, BP, SW, HY, WF, SZ, JSR, WF Conception et développement d'ARNsi : SL, JM, S.Waldron, SH Expériences in vitro : GDG, TP, LM, MDS Administration du projet : EC, MBJ Jeux de données : JMB, VRMC, HVG, RS, BB, KH, BOA, CW, KK, LM,. SS, AS, AT,. OM Supervision : MAF, GDG, YH, KH, LM, KK, AE, JW, AB, CR, GC Rédaction - version originale : KP, GP, GDG, TVZ, CR, GC Tous les auteurs ont contribué à l'obtention du financement, à la conception et à la supervision de l'étude. Tous les auteurs ont examiné la version finale du manuscrit (Équipe de gestion et de direction du RGC). CB, CF, AL et JDO ont effectué et sont responsables du génotypage des échantillons. CB, CF, EDF, ML, MSP, LW, SEW, AL et JDO ont effectué et sont responsables du séquençage de l'exome. TDS, ZG, AL et JDO ont conçu et sont responsables de l'automatisation du laboratoire. MSP, KM, RU et JDO sont responsables du suivi des échantillons et du système de gestion des informations de la bibliothèque. XB, AH, OK, AM, SO, RP, TP, AR, WS et JGR ont exécuté et sont responsables de la logistique informatique, de l'analyse et de l'infrastructure nécessaires pour produire des données d'exome et de génotype. GE, MO, MN et JGR ont fourni le développement de l'infrastructure de calcul et le support opérationnel. SB, S.Ba, SC, KS, SK et JGR ont fourni des annotations de variantes et de gènes et leur interprétation fonctionnelle des variantes. EM, RL, BB, AB, LH, JGR ont conçu et sont responsables de la création, du développement et du déploiement de plateformes d'analyse et de méthodes de calcul pour l'analyse des données génomiques. Tous les auteurs ont contribué à l'informatique clinique du projet (Clinical Informatics). Tous les auteurs ont contribué à l'analyse analytique du projet (Translational and Analytical Genetics). Tous les auteurs ont contribué à la gestion et à la coordination de toutes les activités de recherche, à la planification et à l'exécution. Tous les auteurs ont contribué au processus de révision de la version finale du manuscrit (Research Program Management).

Correspondance avec Aris Baras, Carmelo Romano ou Giovanni Coppola.

Les auteurs déclarent les intérêts concurrents suivants : Les auteurs de Regeneron reçoivent un salaire et possèdent des options et/ou des actions de la société. Le conjoint de CW est un employé du Regeneron Genetics Center. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Saidas Nair, Lulin Huang et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef principaux : Eve Rogers. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

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Praveen, K., Patel, GC, Gurski, L. et al. ANGPTL7, une cible thérapeutique pour l'augmentation de la pression intraoculaire et le glaucome. Commun Biol 5, 1051 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03932-6

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Reçu : 03 septembre 2021

Accepté : 01 septembre 2022

Publié: 03 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03932-6

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