Les extraits de Ginkgo biloba améliorent la circulation choroïdienne conduisant à la suppression de la myopie chez la souris

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3772 (2023) Citer cet article

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La myopie est de plus en plus répandue dans le monde, nécessitant le développement de méthodes préventives. Nous avons étudié l'activité de la protéine Early Growth Response 1 (EGR-1) et découvert que les extraits de Ginkgo biloba (GBE) activaient EGR-1 in vitro. In vivo, des souris C57BL/6 J ont été nourries avec une alimentation mixte normale ou à 0,0667 % GBE (200 mg/kg) (n = 6 chacune), et la myopie a été induite avec des lentilles de -30 dioptries (D) de 3 à 6 semaines. La réfraction et la longueur axiale ont été mesurées par un photoréfracteur infrarouge et un système SD-OCT, respectivement. Chez les souris myopes induites par la lentille, les GBE oraux ont significativement amélioré les erreurs de réfraction (− 9,92 ± 1,53 D contre − 1,67 ± 3,51 D, p < 0,001) et l'allongement axial (0,22 ± 0,02 mm contre 0,19 ± 0,02 mm, p < 0,05). Pour confirmer le mécanisme des GBE dans la prévention de la progression de la myopie, les souris âgées de 3 semaines ont été divisées en groupes normalement nourris avec des groupes induits par la myopie ou non induits par la myopie et des GBE nourris avec des groupes induits par la myopie ou non induits par la myopie (n = 10 chacun). La perfusion sanguine choroïdienne a été mesurée par angiographie par tomographie par cohérence optique (OCTA). Dans les deux groupes induits non myopes, par rapport à la nourriture normale, les GBE oraux ont significativement amélioré la perfusion sanguine choroïdienne (8,48 ± 15,75 % de surface contre 21,74 ± 10,54 % de surface, p <0,05) et l'expression de l'Egr-1 et de l'oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS) dans la choroïde. Dans les deux groupes induits par la myopie, par rapport à la nourriture normale, les GBE oraux ont également amélioré la perfusion sanguine choroïdienne (− 9,82 ± 9,47 % de surface contre 2,29 ± 11,84 % de surface, p <0,05) et étaient positivement corrélés avec le changement d'épaisseur de la choroïde. Ces résultats suggèrent que les GBE peuvent inhiber la progression de la myopie en améliorant la perfusion sanguine choroïdienne.

La myopie est une affection oculaire importante qui touche des personnes partout dans le monde et la moitié de la population mondiale devrait être myope d'ici 2050, car l'incidence de la myopie augmente d'année en année1,2,3. Avec la nouvelle épidémie de coronavirus et une série de politiques de confinement et de quarantaine à domicile, les restrictions sur les activités de plein air ont ravivé le sujet de la myopie4,5. Comment éliminer ou réduire le développement de la myopie est un problème sérieux qui ne peut être ignoré.

À l'heure actuelle, il existe différentes stratégies pour limiter la progression de la myopie. En plus des interventions pharmacologiques bien connues (p. ex., atropine, pirenzépine, 7-méthylxanthine) et des interventions optiques (p. ex., orthokératologie, lentilles à défocalisation périphérique)6,7, passer plus de temps à l'extérieur est également apparu comme l'une des stratégies les plus sûres et les plus importantes pour réduire le développement de la myopie8,9,10. Le facteur le plus important dans l'augmentation du temps passé à l'extérieur est l'exposition à une lumière extérieure vive11.

La lumière extérieure a une composition spectrale dominée par des composants visibles à courte longueur d'onde comme le bleu et le vert plutôt que le rouge12. De plus, il a été rapporté que la lumière bleue inhibe la myopie13. Dans nos études précédentes, il a été démontré que la lumière violette dans l'environnement extérieur, qui a une longueur d'onde plus courte que la lumière bleue, supprime le développement de la myopie chez les modèles de myopie poussin et murin et chez l'homme, et en outre, l'exposition à la lumière violette régule positivement le gène suppresseur de myopie Egr-1 à la fois in vitro et vivo14,15. Egr-1 est un gène codant pour une protéine qui contrôle l'allongement axial et la progression de la myopie16,17,18. De plus, les souris knock-out Egr-1 présentaient une longueur axiale plus longue et un décalage de réfraction myopique19,20,21. Réalisant que l'expression d'Egr-1 pourrait être utilisée comme gène d'évaluation pour la suppression de la myopie, nous avons effectué des tests de luciférase dans la lignée cellulaire cultivée pour cribler 207 substances naturelles et produits chimiques organiques et avons constaté que 75 % ou plus de la pureté de l'extrait de fruit de gardénia contenant de la crocétine A a démontré l'activation maximale d'EGR-122. Il a été démontré que la crocétine supprime le développement de la myopie expérimentale chez la souris et peut avoir un effet suppresseur sur la progression de la myopie chez les enfants22,23. Les extraits de Ginkgo biloba (GBE) se sont révélés être le deuxième activateur le plus puissant de l'EGR-122. Par conséquent, il est raisonnable de supposer que les GBE, comme la crocétine, ont également un effet inhibiteur sur la progression de la myopie.

Le ginkgo est un grand arbre aux feuilles en forme d'éventail. Il est originaire de Chine, du Japon et de Corée, mais est également cultivé en Europe et aux États-Unis. La médecine traditionnelle chinoise utilise les fruits et les graines de l'arbre Ginkgo biloba depuis plus de 5000 ans, avec des recommandations pour le traitement de l'asthme, de la toux et de l'énurésie24,25. Une entreprise pharmaceutique allemande a créé un extrait de ginkgo biloba appelé EGb 761 en 1964, et des centaines de recherches ont exploré les effets du ginkgo sur des modèles humains et animaux depuis lors26. Après des décennies de recherche persistante, il a été démontré que les GBE présentent un large éventail d'actions biologiques, notamment des propriétés antioxydantes27, antivirales28, anti-inflammatoires29,30, antitumorales31,32, immunomodulatrices33 et hépatoprotectrices34. Remarquablement, les GBE sont également apparus comme un traitement potentiel du glaucome et d'autres maladies oculaires ischémiques pour leur impact bénéfique sur la circulation sanguine35,36. L'augmentation de l'allongement axial dans la myopie entraîne un amincissement des tissus rétiniens, choroïdiens et scléraux et interfère avec le flux sanguin oculaire. Il a été constaté que chez les cobayes, l'épaisseur choroïdienne et la perfusion sanguine choroïdienne étaient diminuées lors de l'induction expérimentale de la myopie, puis augmentaient lors de la récupération37,38,39. Par conséquent, nous avons mené une étude visant à évaluer davantage si l'administration orale de GBE peut supprimer la progression de la myopie expérimentale dans un modèle murin et déterminer si les GBE inhibent la myopie en augmentant la perfusion sanguine choroïdienne.

L'effet de différentes concentrations de GBE sur l'activité d'EGR-1 a été détecté par des lignées de cellules EGR-1-Luc du virus adéno-associé du rein embryonnaire humain (cellule HEK 293AAV EGR-1-Luc). Cette lignée cellulaire a été obtenue par une série de transfections et de passages de la lignée cellulaire HEK 293AAV, achetée auprès de Cell Biolabs, Inc. 0,75 mg / ml de GBE ont été utilisés pour les tests d'activité EGR-1, le diméthylsulfoxyde (DMSO) sans composés a été utilisé comme contrôle négatif et le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) a été utilisé comme contrôle positif ( n = 6 pour chaque groupe). Les valeurs du groupe expérimental et du groupe témoin positif sont présentées sous forme de multiples par rapport au groupe témoin négatif. Comparé au groupe témoin négatif, le groupe témoin positif a montré une augmentation statistiquement significative de l'activité EGR-1, l'activation était de 3,57 ± 0,65 fois (p < 0,001). Pour 0,25 mg/ml de GBE, l'activation de l'EGR-1 était de 1,59 ± 0,13 fois (p < 0,001), pour 0,50 mg/ml de GBE, l'activation de l'EGR-1 était de 1,77 ± 0,40 fois (p < 0,01) et pour 0,75 mg/ml de GBE, l'activation de l'EGR-1 était de 1,17 ± 0 0,60 fois (p = 0,520) (Fig. 1).

Effets de diverses concentrations de GBE sur l'activation d'EGR-1 dans un test de luciférase. Les GBE ont été testés à trois doses différentes, et les concentrations de 0,25 mg/ml et 0,5 mg/ml de GBE ont montré une augmentation statistiquement significative de l'activité EGR-1 dans un test de luciférase (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Les barres représentent la moyenne + / - les écarts-types. L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour l'analyse statistique. EGR-1 : protéine 1 de réponse de croissance précoce ; GBE : Extraits de Ginkgo biloba ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; PMA : phorbol 12-myristate 13-acétate.

L'effet de l'administration orale de GBE sur la progression de la myopie a été examiné dans un modèle murin de myopie induite par le cristallin (LIM). Le modèle est à peu près le même que celui établi précédemment40, sauf que l'induction monoculaire de la myopie est remplacée par l'induction simultanée de la myopie dans les deux yeux, ce qui est plus cohérent avec l'agencement de notre expérience. La concentration de GBE que nous avons sélectionnée pour l'administration orale était de 0,0667 % (200 mg/kg/jour), ce qui était la concentration la plus élevée sans provoquer de réactions hépatotoxiques chez la souris. Dans cette étude, seule la dose la plus élevée de GBE dans la plage de sécurité a été utilisée pour déterminer si elle a un effet inhibiteur sur la myopie. Les souris ont été divisées en trois groupes en fonction des lentilles et de l'alimentation, une nourriture normale avec un groupe de lentilles de 0 dioptrie (D) (le groupe témoin 0 D), une nourriture normale avec un groupe de lentilles - 30 D (le groupe témoin - 30 D) et 0, 0667% GBE mélangés avec - groupe de lentilles 30 D (le groupe GBE - 30 D), respectivement (n = 8 pour chaque groupe). Dans les deux groupes nourris avec de la nourriture normale, les yeux traités avec une lentille − 30 D avaient un décalage de réfraction significativement plus élevé que les yeux traités avec 0 D (− 9,92 ± 1,53 D vs + 11,14 ± 6,60 D, p < 0,001) (Fig. 2A). Par rapport au groupe de chow normal avec une lentille − 30 D, les souris ayant reçu une alimentation mixte GBE ont présenté un changement de réfraction significativement moins important avec une lentille − 30 D (− 9, 92 ± 1, 53 D contre − 1, 67 ± 3, 51 D, p <0, 001) (Fig. 2A). Les changements de longueur axiale étaient les suivants, les yeux traités avec une lentille - 30 D ont montré un allongement axial significatif par rapport aux yeux traités avec une lentille 0 D dans les groupes chow normaux (0, 22 ± 0, 02 mm vs 0, 19 ± 0, 01 mm, p <0, 01) (Fig. 2B). Dans les yeux avec lentilles − 30 D, le groupe GBE − 30 D a montré un allongement axial significativement plus faible par rapport au groupe témoin − 30 D (0,19 ± 0,02 mm vs 0,22 ± 0,02 mm, p < 0,05) (Fig. 2B). Ces résultats suggèrent que dans un modèle LIM murin, l'administration orale de GBE a réduit un décalage de réfraction et un allongement axial. De plus, nous avons également mesuré le changement de la somme de l'épaisseur de la cornée et de la profondeur de la chambre antérieure et le changement de l'épaisseur du cristallin dans les trois groupes de souris, et aucun changement significatif n'a été observé (Fig. 1 supplémentaire). De multiples études ont montré que la longueur axiale est particulièrement liée à l'épaisseur choroïdienne dans la myopie41,42,43,44. Ainsi, nous considérons que l'allongement de la longueur axiale induit par la myopie entraîne également la réponse choroïdienne associée.

Les GBE ont supprimé de manière significative un décalage de réfraction myope et un allongement axial dans un modèle LIM murin. (UN). Dans les groupes témoins 0 D et − 30 D, les yeux traités avec des verres − 30 D avaient un décalage de réfraction significativement plus important que les yeux traités avec des verres 0 D (p < 0,001). Par rapport au groupe témoin − 30 D, les souris du groupe GBE − 30 D ont montré un décalage de réfraction significativement réduit (p < 0,001) (n = 8). (B). Comparativement au groupe témoin 0 D, le groupe témoin − 30 D a montré un allongement axial significatif (p < 0,01). Comparativement au groupe témoin − 30 D, le groupe GBE − 30 D a montré un allongement axial significativement plus faible (p < 0,05) (n = 8). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, les barres représentent la moyenne + / - les écarts-types. L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour déterminer les différences significatives.

Pour démontrer le mécanisme suppressif de la progression de la myopie, les souris ont été réparties au hasard en 4 groupes : lentilles 0D avec groupe régime normal (Contrôle 0D), lentilles 0D avec groupe régime GBE (GBEs 0D), myopie binoculaire induite avec groupe régime normal (Contrôle - 30D) et myopie binoculaire induite avec groupe régime GBE (GBE - 30D) (n = 10 pour chaque groupe). La perfusion sanguine choroïdienne a été mesurée par angiographie par tomographie par cohérence optique (OCTA), qui peut fournir des images En face et B-scan des systèmes vasculaires choroïdiens. Dans l'image globale du visage En (Fig. 3A-1), un cadre carré d'une taille de 9 mm (largeur) \(\ fois \) 9 mm (longueur) est sélectionné pour la photographie OCTA afin d'obtenir une image partielle du visage En centrée sur le nerf optique (Fig. 3A-2). L'image B-scan correspondant aux lignes horizontales traversant le centre du nerf optique dans l'angiographie du visage En a été analysée comme une norme unifiée. Dans l'image B-scan relative, la choroïde est représentée par la zone de signal en surbrillance blanche dans la bobine jaune (Fig. 3A-3). Avec l'ajout de l'angiographie, les points rouges représentent les signaux sans perfusion sanguine, tandis que la zone au-delà des points rouges représente la zone à travers laquelle passe la perfusion sanguine (Fig. 3A-4). La proportion de pixels rouges sur la région choroïde a été mesurée par ImageJ, et la perfusion sanguine choroïdienne a été calculée en notant le pourcentage de pixels non rouges sur la région choroïde totale. Dans l'histogramme de la variation de la perfusion sanguine choroïdienne, par rapport au groupe témoin 0D, les souris du groupe GBEs 0D ont montré une variation significativement plus importante de la perfusion sanguine (8,48 ± 15,75 % de surface contre 21,74 ± 10,54 % de surface, p < 0,05) après 3 semaines d'alimentation, tandis que les souris du groupe témoin - 30D ont montré une diminution de la perfusion sanguine choroïdienne (8,4 8 ± 15,75 % de surface contre − 9,82 ± 9,47 % de surface, p < 0,01). En cas d'induction de la myopie, la perfusion sanguine choroïdienne était améliorée dans le groupe GBE − 30D, par rapport au groupe témoin − 30D (2,29 ± 11,84 % de surface contre − 9,82 ± 9,47 % de surface, p < 0,05) (Fig. 3B).

Les GBE ont augmenté la perfusion sanguine choroïdienne dans un modèle murin. (UN). La perfusion sanguine choroïdienne a été mesurée par OCTA, qui permet une angiographie en face de la choroïde et le B-scan correspondant. (A-1). Image d'angiographie en face. (A-2). Angiographie de 9 mm de longueur et de largeur centrée sur le nerf optique. (A-3). L'angiographie de face En correspond à l'image B-scan. La région choroïde est encerclée en jaune sur l'image B-scan. (A-4). OCTA a généré un angiogramme B-scan de la couche choroïde. La proportion des points rouges dans la région choroïde a été calculée à l'aide de l'outil de mesure de zone dans ImageJ, la zone au-delà du point rouge (100-%Area) est la zone de perfusion sanguine choroïdienne. (B). Les modifications de la perfusion sanguine choroïdienne après 3 semaines d'alimentation des GBE étaient significativement plus élevées que celles du groupe d'alimentation normale, que l'induction de la myopie ait été réalisée ou non (p < 0,05) (n = 10). *p < 0,05, **p < 0,01, les barres représentent la moyenne + / - les écarts-types. L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour déterminer les différences significatives.

Pour vérifier davantage le mécanisme des GBE dans l'inhibition de la progression de la myopie, nous avons collecté les échantillons choroïdiens et rétiniens des souris du groupe Control 0D et du groupe GBEs 0D pour la PCR en temps réel (n = 8 pour chaque groupe). Les résultats ont montré une augmentation significative de l'expression de l'ARNm d'Egr-1 dans la choroïde après 3 semaines d'alimentation des GBE par rapport au groupe témoin nourri avec de la nourriture normale pendant 3 semaines (7,11 ± 4,5 fois contre 2,34 ± 2,52 fois, p < 0,05). Dans la rétine, l'expression de l'ARNm d'Egr-1 était significativement régulée positivement après 3 semaines d'alimentation des GBE par rapport au groupe témoin (1, 69 ± 0, 73 fois contre 1, 11 ± 0, 53 fois, p <0, 05) (Fig. 4A). De plus, l'expression de l'ARNm d'eNOS était significativement régulée à la hausse dans la choroïde après 3 semaines d'alimentation des GBE par rapport au groupe témoin (2, 56 ± 0, 97 fois contre 0, 72 ± 0, 55 fois, p <0, 01) (Fig. 4B).

L'expression de l'ARNm d'Egr-1 et d'eNOS était significativement régulée positivement dans la choroïde par l'administration de GBE. (A) L'expression de l'ARNm d'Egr-1 a montré une augmentation significative des échantillons choroïdiens et rétiniens après 3 semaines d'administration orale de GBE, par rapport au groupe témoin nourri à la nourriture normale (p <0,05) (n = 8). (B) L'expression de l'ARNm d'eNOS a également montré une augmentation significative de la choroïde après 3 semaines d'alimentation des GBE par rapport au groupe témoin (p < 0,01) (n = 8). *p < 0,05, **p < 0,01, les barres représentent la moyenne + / - les écarts-types. Ch : choroïde ; R : Rétine ; GBE : Extraits de Gingko biloba.

Les expériences ci-dessus ont vérifié que l'administration de GBE peut augmenter la quantité de perfusion sanguine dans la choroïde, qu'elle soit accompagnée ou non d'une induction de myopie. Par la suite, pour explorer l'influence des modifications de la perfusion sanguine choroïdienne causées par l'administration de GBE sur l'épaisseur de la choroïde, des souris portant des lentilles 0D ont été nourries avec de la nourriture normale et de la nourriture à 0, 0667% de GBE respectivement, et l'épaisseur de la choroïde a été mesurée après 3 semaines d'alimentation, nous avons constaté que l'épaisseur de la choroïde s'épaississait de manière significative dans le groupe de nourriture à 0, 0667% de GBE (Fig. 2 supplémentaire). Ensuite, une myopie a été induite chez des souris âgées de 3 semaines et nourries avec de la nourriture normale ou de la nourriture mélangée à 0,0667% de GBE jusqu'à l'âge de 6 semaines, les changements d'épaisseur de la choroïde avant et après l'alimentation ont été comparés entre les groupes (n = 6 pour chaque groupe). Dans le groupe contrôle − 30 D, une diminution significative de l'épaisseur choroïdienne a été mise en évidence par rapport au groupe contrôle 0 D (− 1,55 ± 0,47 um vs + 2,10 ± 0,80 um, p < 0,001) (Fig. 5). Par rapport au groupe témoin - 30 D, les souris du groupe GBE - 30 D ont présenté un changement d'épaisseur choroïdienne significativement moindre (- 1, 55 ± 0, 47 um vs - 0, 28 ± 0, 81 um, p < 0, 01) (Fig. 5). Ces résultats corroborent davantage les preuves existantes selon lesquelles le changement de perfusion sanguine choroïdienne était positivement corrélé au changement d'épaisseur choroïdienne dans un modèle LIM murin.

L'administration de GBE a réduit l'amincissement choroïdien. Les deux groupes qui ont reçu une alimentation normale ont montré une différence significative d'épaisseur choroïdienne entre le groupe de lentilles - 30 D et le groupe de lentilles 0 D (p < 0,001). Les souris ayant reçu des GBE chow avec des lentilles - 30 D ont montré une augmentation statistiquement significative de l'épaisseur de la choroïde par rapport au groupe de chow normal avec des lentilles - 30 D (p < 0, 01) (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001, les barres représentent la moyenne + / - les écarts-types. L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour l'analyse statistique. Témoin 0 D : souris nourries avec de la nourriture normale avec des lentilles 0 D dans les deux yeux ; contrôle − 30 D : souris nourries avec une nourriture normale avec lentilles − 30 D dans les deux yeux ; GBE − 30 D : souris nourries avec des GBE avec lentilles − 30 D dans les deux yeux.

Dans cette étude, l'activation des GBE in vitro pour l'EGR-1 à l'aide du dosage de la luciférase a été mesurée et l'activation dose-dépendante des GBE sur l'EGR-1 a été confirmée. À la suite de cette expérience, l'effet suppresseur de l'administration orale de GBE sur la progression de la myopie a été étudié à l'aide d'un modèle LIM murin et il a été constaté que l'administration orale de GBE pouvait inhiber les changements de réfraction et de longueur axiale. Par la suite, dans des conditions d'induction de la myopie et d'absence d'induction de la myopie, en comparant les modifications de la perfusion sanguine choroïdienne chez les souris recevant des GBE par voie orale avec des souris non administrées, il a été constaté que l'administration orale de GBE augmentait de manière significative la perfusion sanguine choroïdienne chez les souris avec ou sans induction myopique. En outre, une régulation à la hausse significative de l'ARNm d'Egr-1 et d'eNOS après les GBE oraux a également été confirmée à l'aide de la PCR en temps réel. Les diminutions d'épaisseur choroïdienne ont été atténuées après l'administration orale de GBE dans un modèle murin de LIM.

La principale catégorie d'ingrédients actifs des GBE sont les ginkgolides, les bilobalides (également appelés terpènes) et les flavonoïdes45,46. Les flavonoïdes ont la capacité de dilater les artères sanguines en stimulant la libération de facteurs relaxants dérivés de l'endothélium et de prostacycline47. Les premières études ont noté l'influence des GBE sur le flux sanguin. L'administration orale de GBE a été prouvée dans des modèles animaux pour soulager considérablement l'ischémie cérébrale et myocardique, ainsi que pour réduire les dommages ischémiques ultérieurs48,49,50. Dans l'application des maladies oculaires, après l'administration orale des GBE, la vitesse télédiastolique dans l'artère ophtalmique et le flux sanguin oculaire ont augmenté, ce qui a un grand potentiel thérapeutique pour certaines maladies oculaires ischémiques et est actuellement utilisé comme option de traitement potentielle pour le glaucome à tension normale35,51,52. Dans notre recherche, l'OCTA a été utilisé pour la première fois dans un modèle murin pour évaluer les modifications de la perfusion sanguine choroïdienne avec et sans administration orale de GBE. Avant notre étude, il y avait eu des études qui utilisaient l'OCTA pour mesurer la perfusion sanguine choroïdienne dans des modèles myopes de cobayes38,39,53. Ces études fournissent un support technique solide pour l'application de l'OCTA dans des modèles murins. L'OCTA peut réduire les bruits d'image en quelques secondes, en augmentant les détails et en améliorant la visibilité et la précision de la mesure de la perfusion sanguine choroïdienne54. Notre expérience a intuitivement démontré qu'avec ou sans induction myopique, une augmentation de la perfusion sanguine choroïdienne était détectée après 3 semaines d'alimentation des GBE. et combiné les caractéristiques des GBE dans l'amélioration de la perfusion sanguine choroïdienne avec l'inhibition de la progression de la myopie, ce qui prouve l'association entre la myopie et la perfusion sanguine choroïdienne.

Pour vérifier le mécanisme possible de suppression de la progression de la myopie par l'administration de GBE, nous avons utilisé la PCR en temps réel pour détecter les expressions d'Egr-1 et d'eNOS dans la rétine et la choroïde après trois semaines d'administration orale de GBE. La justification de l'observation de l'expression d'eNOS est que des études antérieures ont révélé qu'eNOS régule le tonus vasculaire et l'angiogenèse, et que son expression était élevée dans les artères soumises à un flux sanguin plus élevé55,56. Conformément aux résultats de l'expérience in vitro, après administration orale de GBE, l'expression d'Egr-1 était significativement régulée positivement à la fois dans la choroïde et la rétine. Pour l'expression d'eNOS, la choroïde a montré une régulation à la hausse considérable de l'expression d'eNOS, alors que la rétine a montré une tendance mais pas une augmentation statistiquement significative. Ces résultats correspondent à une augmentation de la perfusion sanguine choroïdienne évaluée par OCTA. Par conséquent, nous considérons qu'il peut y avoir deux mécanismes différents par lesquels les GBE suppriment la progression de la myopie. Premièrement, il supprime la croissance axiale des yeux en régulant à la hausse l'expression d'Egr-1 dans la choroïde et la rétine. En outre, spéculez à partir de nos résultats expérimentaux, l'administration de GBE induit la régulation à la hausse de l'expression d'eNOS dans la choroïde, qui peut détendre les cellules musculaires lisses vasculaires, dilate les vaisseaux vasculaires choroïdiens, augmente la perfusion sanguine choroïdienne et maintient l'épaisseur de la choroïde et la position de la rétine, conduisant à la suppression du développement de la myopie. De plus, certaines études ont également montré que le traitement avec des GBE augmente la libération de dopamine dans le cortex préfrontal médial du rat57,58. La dopamine, en tant que neurotransmetteur majeur de la rétine, favorise sa libération et peut inhiber le développement de la myopie59. On en déduit qu'un autre mécanisme par lequel les GBE inhibent la progression de la myopie peut être qu'il induit la libération de dopamine dans la rétine, ce qui doit être vérifié par d'autres expériences.

Cependant, cette étude présente certaines limites. Seule une concentration de 0,0667% de GBE a été retenue pour vérifier son effet suppresseur sur la progression de la myopie. La sélection de la concentration d'administration orale des GBE a été résumée à partir de plusieurs rapports de tests pharmacologiques des GBE sur des souris. Des doses orales de 100 à 400 mg/kg ont été signalées, et des doses de GBE supérieures à 200 mg/kg se sont avérées hépatotoxiques chez les rongeurs60,61,62,63,64. Dans cette expérience, nous avons préparé 0,0667 % de GBE contenant de la nourriture, ce qui correspond à 200 mg/kg, pour vérifier son effet suppresseur sur la progression de la myopie. Étant donné que la concentration de médicament utilisée était considérablement élevée, d'autres études sont nécessaires pour définir plusieurs groupes de concentrations différentes afin de mieux comprendre la concentration optimale d'administration orale de GBE pour supprimer la progression de la myopie.

La prévalence de la myopie augmente rapidement et continuellement partout dans le monde, il est urgent d'explorer et de développer des méthodes permettant de contrôler la myopie chez les enfants. Jusqu'à présent, notre recherche est la première à démontrer comment les GBE, un extrait naturel, contrôlent efficacement la myopie chez la souris. En tant que recherche préliminaire basée sur des essais cliniques, notre recherche a jeté les bases de la recherche sur l'administration des GBE supprimant la progression de la myopie et offre la possibilité d'expériences ultérieures liées à la dose. Pour les humains, les GBE sont généralement bien tolérés et inoffensifs, mais peuvent également provoquer des effets secondaires. Il a été rapporté que la dose maximale recommandée pour les GBE est de 240 mg/jour pour les adultes65, mais il n'y a pas eu d'études définitives sur les doses recommandées pour les enfants. Pour les futures études cliniques prospectives, comment déterminer la dose sûre et exploiter pleinement l'impact des GBE sur l'inhibition de la myopie chez les enfants sont des sujets qui nécessitent une discussion approfondie.

Le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Keio a autorisé toutes les opérations (numéro d'approbation : 16017). Toutes les méthodes et tous les protocoles expérimentaux ont suivi les directives des National Institutes of Health (NIH) pour travailler avec des animaux de laboratoire et la déclaration ARVO Animal for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Notre étude suivait également les directives ARRIVE et respectait le principe d'assignation aléatoire.

La lignée cellulaire 293AAV est dérivée de la lignée cellulaire parentale 293 et développée par Cell Biolabs, Inc. après clonage et plusieurs séries de tests (Cell Biolabs, Inc. California, USA cat#AAV-100). La lignée cellulaire HEK 293AAV achetée auprès de la société a été transfectée avec la construction du gène rapporteur Egr1-luciférase (Cignal Lenti EGR1 Reporter (Luc), Qiagen, Venlo, Pays-Bas) pour surveiller l'activité transcriptionnelle d'EGR-1. La méthode a suivi la voie décrite précédemment22. En bref, le virus Cignal Lenti Egr-1 reporter Luc (QIAGEN, Pays-Bas #CLS-5021L) a été utilisé pour infecter des cellules pendant moins de 20 h à l'aide du réactif de transduction SureENTRY (QIAGEN, Pays-Bas #336 921). (25 MOI). Après l'infection, les cellules ont subi un passage puis ont été cultivées jusqu'à ce qu'aucune cellule infectée ne meure entièrement. Cinq colonies ont été prélevées et ensemencées dans 2,0 × 104 cellules/puits dans la plaque réceptrice HTS Transwell®-96. Parmi toutes les lignées cellulaires transfectées avec la construction du gène rapporteur Egr-1-luciférase achetée par notre laboratoire, la lignée cellulaire HEK 293AAV EGR-1-Luc était la plus capable d'exprimer de manière stable l'activité EGR1 après le traitement PMA (contrôle positif), ainsi, cette lignée cellulaire a été choisie comme la colonie la plus réactive pour le test de dépistage.

Le dosage de la luciférase a été effectué comme indiqué précédemment22. Les cellules HEK 293AAV EGR-1 qui ont été passées deux fois ont été transférées sur HTS Transwell®-96 Receiver Plate, White, TC-Treated, Sterile (Corning, New York, USA #3783), additionnées de 70 ul de milieu contenant 10 % de FBS dans chaque puits et le nombre de cellules par puits était de 2,0 × 104, incubées pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Les GBE (INDENA JAPAN CO., Tokyo, Japon #9 033 008) ont été pesés et dissous dans du DMSO (Wako, Tokyo, Japon #043-07 216) pour former une solution à 100 mg/ml et laissés à l'abri de la lumière pendant une nuit à température ambiante après agitation. Dissolvez le surnageant dans du DMSO dans un rapport de 1:400, 2:400, 3:400, de sorte que la concentration finale devienne 0,25 mg/ml, 0,50 mg/ml et 0,75 mg/ml, ajoutez-les à 70 ul dans chaque puits. Les cellules ont été incubées pendant 18 h à 37 ° C dans un incubateur à 5 % de CO2.

Un contrôle positif de 100 nM de PMA (Promega, USA #V1171 ou Abcam, Angleterre #16,561-29-8) a été utilisé, connu sous le nom d'activateur EGR-166. Un milieu contenant du DMSO sans aucun produit chimique a été utilisé comme contrôle négatif. La concentration de GBE que nous avons utilisée était de 0,25 mg/ml, 0,50 mg/ml et 0,75 mg/ml, respectivement. Tout d'abord, dans des études antérieures, nous avons trouvé que 0,25 mg/ml de crocétine était la concentration maximale soluble dans le DMSO, qui induisait une activation significative d'Egr-1 dans un dosage de la luciférase22. Sur la base de cette expérience, nous avons configuré 0,25 mg/ml de GBE comme concentration préférée. Deuxièmement, pour les souris, plusieurs études ont confirmé que les GBE nourris à plus d'une dose quotidienne de 200 mg/kg peuvent provoquer une hépatotoxicité chez les rongeurs62,63,64. Après conversion de concentration, la concentration expérimentale in vivo correspondant à la concentration alimentaire de 200 mg/kg/jour est de 0,50 mg/ml. Par conséquent, nous avons défini 0,5 mg/ml de GBE comme deuxième concentration. Enfin, 0, 75 mg / ml de GBE ont été définis comme troisième concentration pour explorer le changement d'activité d'EGR-1 dans des conditions de concentration ultra-élevée in vitro. Le système de dosage ONE-GloTM Luciferase (Promega, Madison, Wisconsin, USA #E6110) a été utilisé pour quantifier l'expression de la luciférase. Après avoir mélangé uniformément 10 ml de tampon de dosage de la luciférase Glo™ et 1 flacon de substrat de dosage de la luciférase ONE-Glo™ du système de dosage de la luciférase ONE-Glo™, ajouter 70 ul pour chaque puits. Nous identifions l'intensité de fluorescence à Synergy HTX (Biotek, Vermont, USA) dans les conditions suivantes : agitation linéaire pendant 30 s, retard pendant 12 min, gain 180, temps d'intégration 0,5 s et hauteur de lecture 1,0 mm.

Des souris C57BL6/J (CLEA, Shizuoka, Japon) ont été maintenues dans des cages à souris transparentes conventionnelles (29 × 18 × 13 cm) de quatre ou cinq par cage dans une pièce climatisée maintenue à 23 ± 3 °C avec une période diurne de 12 h et un accès illimité à la nourriture normale (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japon) et à l'eau du robinet. Pour les souris nourries aux GBE, comme la prise alimentaire moyenne d'une souris de 10 g est d'environ 3 g par jour67,68, l'alimentation a été effectuée selon la prise alimentaire hebdomadaire approximative par cage que nous avons calculée. Le poids des souris a été enregistré chaque semaine pour s'assurer que l'alimentation des GBE n'affectait pas leur gain de poids par rapport aux souris à prise alimentaire normale, les enregistrements n'ont montré aucune différence significative de poids corporel entre les groupes d'alimentation normale et les groupes d'alimentation des GBE (Fig. 3 supplémentaire). Changez la nourriture, l'eau du robinet et la cage une fois par semaine pour vous assurer que l'espace de vie des souris est propre. Pour l'anesthésie, la dose d'anesthésie a été ajustée en fonction du poids corporel de chaque souris, en veillant à ce qu'environ 0,1 ml/10 g d'anesthésie aient été administrés. Pour minimiser les erreurs, toutes les expériences ont utilisé des souris du même sexe (mâle) et du même poids (10 ± 1 g), et toutes les souris ont été assignées au hasard. Pour assurer l'uniformité de l'expérience et minimiser l'influence des facteurs objectifs sur les résultats expérimentaux, pendant toute l'expérience, toutes les souris ont été maintenues dans des conditions de lumière et de température uniformes, en veillant à ce que le temps de chaque mesure d'expérience soit cohérent, et le temps de mesure moyen de chaque souris a été essayé pour être le même.

Un modèle LIM murin a été préparé comme indiqué précédemment40. Nous avons créé une monture de lunettes de souris qui épouse le contour de la tête de la souris et l'avons imprimée à l'aide d'une imprimante tridimensionnelle. Une lentille négative 30 D en PMMA a été créée pour l'induction de la myopie. L'induction myopique à l'aide de la lentille − 30 D a montré un décalage myopique plus important par rapport au modèle myopique à privation de forme40. Avec quelques différences par rapport au modèle LIM utilisé précédemment, nous avons utilisé l'induction myopique binoculaire au lieu de l'induction monoculaire. Les yeux gauche et droit des lunettes ont été ajustés par la forme du cadre du crâne de la souris et fixés sur le bâton avec une vis, puis collés le bâton au crâne de la souris avec un système adhésif dentaire auto-durcissant. Cela a été fait sous anesthésie générale avec la combinaison de midazolam (Sandoz KK, Minato, Japon), de médétomidine (Domitor®, Orion Corporation, Turku, Finlande) et de tartrate de butorphanol (Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japon) (MMB). La dose pour chaque souris était de 0,01 ml/g.

Au cours de la phase d'induction de la myopie, les souris ont reçu une alimentation normale (MF, Oriental Yeast Co., Ltd, Tokyo, Japon) ou mixte contenant le produit chimique candidat à 0,0667 % de GBE (INDENA JAPAN CO., Tokyo, Japon #9 033 008). Les GBE à 0,0667 % contiennent 24 % des glycosides de flavonol de la quercétine, du kaempférol et de l'isorhamnétine et 6 % des trilactones terpéniques. La concentration correspondante de nourriture mixte GBE était de 200 mg/kg/jour, ce qui est cohérent avec la concentration de GBE qui provoque l'activité significativement élevée des expériences in vitro EGR-1. L'ajout de GBE et la production de nourriture mixte à 0,0667% de GBE sont tous produits par une société de fabrication de nourriture (Oriental Yeast Co., LTD., Tokyo, Japon).

Au début (3 semaines) et à la fin (6 semaines) de l'induction de la myopie, la réfraction, la longueur axiale et l'épaisseur choroïdienne ont été mesurées à l'aide d'un photoréfracteur infrarouge (Steinbeis Transfer Center, Stuttgart, Bade-Wurtemberg, Allemagne) et d'un système SD-OCT (Envisu R4310, Leica, Microsystems, Wetzlar, Allemagne). Toutes les mesures ont été effectuées avec des gouttes oculaires mydriase contenant 0,5% de tropicamide et 0,5% de phényléphrine (Santen Pharmaceutical Co., Ltd, Osaka, Japon) et toutes ont été réalisées sous anesthésie générale MMB. Les valeurs de réfraction ont été mesurées avec une piste de données continue. Parallèlement à la réflexion du vertex cornéen, la longueur axiale a été mesurée de la surface cornéenne antérieure à l'épithélium pigmentaire rétinien40. L'épaisseur choroïdienne a été mesurée selon le rapport précédent22,69. Brièvement, l'épaisseur choroïdienne moyenne a été calculée par la zone choroïdienne éloignée du disque, à la frontière de l'épithélium pigmentaire rétinien et de la surface postérieure de la choroïde, le rayon à 0,5 mm du disque annelé a été obtenu par analyse quantitative ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Bethesda, Maryland, USA). L'épaisseur moyenne de la choroïde a ensuite été déterminée en divisant la surface par la circonférence.

Pour comparer les effets des facteurs alimentaires sur la réfraction, la longueur axiale et l'épaisseur de la choroïde chez la souris, des souris C57BL6/J âgées de 3 semaines ont été réparties au hasard dans le groupe témoin 0 D, le groupe témoin − 30 D et le groupe GBE − 30 D. Le groupe témoin 0 D et le groupe témoin − 30 D ont été nourris avec de la nourriture normale et portaient respectivement des lentilles 0 D et − 30 D sur les deux yeux. Le groupe GBEs - 30 D a été nourri avec 0,0667% de nourriture mixte GBEs tout en portant des lentilles - 30 D sur les deux yeux. Pendant cette période, l'induction de la myopie a été réalisée simultanément. L'alimentation et l'induction myopique ont été réalisées entre 3 et 6 semaines d'âge. Puisque nous avons utilisé l'induction de la myopie binoculaire au lieu de l'induction de la myopie monoculaire, les données de chaque œil ont été analysées indépendamment. Pour comparer les effets des facteurs alimentaires sur la perfusion sanguine choroïdienne chez la souris, des souris C57BL6/J âgées de 3 semaines ont été réparties au hasard en 4 groupes, deux groupes ont reçu un régime normal et un régime GBEs sans induction myopique, et les deux autres groupes ont reçu un régime normal et un régime GBEs pendant l'induction myopique. Ils ont été nourris de 3 à 6 semaines.

La perfusion sanguine choroïdienne a été mesurée au stade initial (3 semaines) et au stade final (6 semaines) à l'aide d'un appareil SS-OCT / OCTA (XEPHILIO OCT-S1, CANON Medical Systems, Tokyo, Japon), qui adopte la technologie de source balayée pour permettre à la source lumineuse d'atteindre profondément dans le fond d'œil, et une large gamme allant du vitré à la rétine, la choroïde et la limite de la sclérotique peut être imagée en haute définition. L'OCTA détermine le flux sanguin in vivo en analysant les variations d'intensité et d'informations de phase à partir de la mobilité des globules rouges observée par des scans OCT répétés au même endroit70,71. Une zone carrée de 9 mm (largeur) \(\ fois \) 9 mm (longueur) centrée sur le nerf optique a été sélectionnée pour construire l'angiographie du visage En, tandis que 464 OCTA B-scans consécutifs au niveau de la rétine-choroïde-sclérotique complète ont été obtenus à chaque position d'enregistrement pour observer les changements du signal de perfusion sanguine à différentes positions. Étant donné que chaque angiographie a une image B-scan correspondante, dans notre recherche, les images B-scan correspondant à l'angiographie du visage En dans la région centrale du nerf optique ont été analysées comme une norme unifiée. Dans l'image B-scan, nous avons observé qu'il n'y avait pas de point rouge couvrant les vaisseaux choroïdes, et les résultats obtenus après avoir calculé la zone non couverte par les points rouges car la perfusion sanguine choroïdienne étaient cohérents avec les résultats de recherche existants, c'est-à-dire que la perfusion sanguine choroïdienne a diminué avec l'induction de la myopie38. Ainsi, nous avons considéré que pour les souris C57BL6/J, le signal de perfusion sanguine est inversé en dessous du RPE en raison des particules de pigment abondantes dans la couche RPE. La zone sans perfusion sanguine est recouverte de points de bruit rouges, également appelés vides d'écoulement (FV), et certaines études ont montré que la perfusion sanguine choroïdienne était négativement corrélée avec les FV de choriocapillaris72,73. Dans cette étude, nous avons utilisé l'outil de sélection de polygones d'ImageJ pour encercler toute la région choroïde dans l'image B-scan et analyser le rapport de surface des FV dans toute la région choroïde, qui était une sélection de seuil algorithmique utilisée pour calculer la proportion de pixels rouges. La perfusion sanguine choroïdienne a été calculée en notant le pourcentage de pixels non rouges par rapport au nombre total de pixels.

Après l'évaluation de la perfusion sanguine choroïdienne par OCTA, les souris ont reçu une surdose de MMB pour produire une anesthésie profonde et euthanasiées par luxation cervicale. Par la suite, les globes oculaires ont été énucléés pour séparer les tissus choroïdiens et rétiniens qui ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide et maintenus à - 80 ° C.

Pour la PCR en temps réel, les tissus ont été lysés dans le réactif TRI (MOR, Miami, FL, USA #TR118) pour solubiliser les protéines dénaturées et séparer l'ARN tissulaire. Ajouter RWT (QIAGEN, Hilden, Allemagne, # 1 067 933) et RPE (QIAGEN, Hilden, Allemagne, # 1 018 013), qui ont été dissous dans EtOH dans un rapport de 1: 2 et 1: 4 pour isoler les petits ARN et éliminer les traces de sels. Les échantillons d'ARN ont été dissous dans de l'eau sans Rnase (TAKARA HOLDINGS INC., Kyoto, Japon, 9012) et mesurés avec un spectrophotomètre (NanoDrop; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) pour l'analyse de l'expression génique.

L'extrait d'ARN (200 ng) a été converti en ADNc en utilisant 4xDN Master Mix avec gDNA remover (TOYOBO, Osaka, Japon, #FSQ-301), 5xRT Master MixII.SYBR green RT-PCR a été réalisé en utilisant THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japon, #QPS-201), et la PCR a été réalisée en utilisant le système de PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems, Waltham, Massachusetts , États-Unis). La méthode 2 − ΔΔCt a été utilisée pour quantifier l'expression différentielle des gènes, qui a ensuite été normalisée au gène de référence (GAPDH). Les séquences d'amorces pour qPCR étaient les suivantes : souris Egr-1 vers l'avant : CCACAACAACAGGGAGACCT, souris Egr-1 vers l'arrière : ACTGAGTGGCGAAGGCTTTA, souris eNOS vers l'avant : TCCGGAAGGCGTTTGATCsouris eNOS vers l'arrière : GCCAAATGTGCTGGTCACCsouris GAPDH vers l'avant : AGGAGCGAGACCACTAACsouris GAPDH vers l'arrière : GATGACCCTTTTGGCTCCAC

Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type (SD) et analysés à l'aide d'une procédure en aveugle. Un test t indépendant ou une ANOVA unidirectionnelle a été utilisé pour évaluer la signification statistique des différences (Microsoft Excel 2003, États-Unis), et les résultats avec des valeurs de p < 0,05 ont été considérés comme significatifs. L'analyse de puissance a été réalisée sur le Cancer Research Network (SWOG), utilisé pour les résultats avec une p-value < 0,05, la puissance calculée est toute supérieure à 0,8.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires.

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Les auteurs remercient Y. Soejima, K. Nishimaki, H. Aoyagi et M. Shidomi (ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd. Tokyo) pour leur discussion critique. Remercions A. Ishida, S. Kurobane, N. Serizawa, C. Shoda (École supérieure de médecine, Université Keio, Tokyo) pour leurs conseils techniques et leur soutien administratif. Des brevets ont été appliqués à l'échelle internationale, sur la base d'un brevet international WO2018/212152.

L'étude actuelle a été soutenue financièrement par ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jing Hou et Kiwako Mori.

Département d'ophtalmologie, École de médecine de l'Université Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo, 160-8582, Japon

Jing Hou, Kiwako Mori, Shin-ichi Ikeda, Heonuk Jeong, Hidemasa Torii, Kazuno Negishi, Toshihide Kurihara et Kazuo Tsubota

Laboratoire de photobiologie, École de médecine de l'Université Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo, 160-8582, Japon

Jing Hou, Kiwako Mori, Shinichi Ikeda, Heonuk Jeong, Hidemasa Torii et Toshihide Kurihara

Tsubota Laboratory, Inc., 304 Toshin Shinanomachi-ekimae Bldg., 34 Shinanomachi Shinjuku-ku, Tokyo, 160-0016, Japon

Kazuo Tsubota

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JH a mené les expériences, analysé les données, préparé les figures et rédigé le manuscrit. KM, TK et KT ont conçu l'étude, ont participé à sa conception et à sa coordination et ont aidé à rédiger le manuscrit. Tous les auteurs ont contribué aux révisions du manuscrit. La version finale du manuscrit a été autorisée par tous les auteurs, qui acceptent également d'être responsables de son contenu.

Correspondance avec Toshihide Kurihara ou Kazuo Tsubota.

En dehors du travail soumis, Kazuo Tsubota rapporte qu'il est le PDG de Tsubota Laboratory, Inc., Tokyo, Japon, une société développant des produits pour le traitement de la myopie. Les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

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Réimpressions et autorisations

Hou, J., Mori, K., Ikeda, Si. et coll. Les extraits de Ginkgo biloba améliorent la circulation choroïdienne conduisant à la suppression de la myopie chez la souris. Sci Rep 13, 3772 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30908-1

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Reçu : 18 août 2022

Accepté : 03 mars 2023

Publié: 07 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-30908-1

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