À travers l'aorte dégagée : trois

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 8632 (2022) Citer cet article

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La média de la paroi aortique est caractérisée par des couches altérées d'élastine et de cellules musculaires lisses (SMC), ainsi que des fibres de collagène dans les deux couches, et joue un rôle central dans le remodelage fonctionnel et pathologique tel que l'hypertension et l'athérosclérose. Parce que la fonction artérielle est étroitement liée à la structure interne de la paroi artérielle, il est essentiel d'étudier l'altération de la microstructure artérielle au cours de la déformation macroscopique pour comprendre les pathologies cardiovasculaires. La présente étude a adopté une méthode de compensation des tissus dans la caractérisation mécanique tridimensionnelle de l'aorte thoracique du rat et a observé avec succès des changements dans la structure de chacun des trois principaux composants de l'aorte sous pressurisation intraluminale tout en maintenant l'intégrité mécanique et la flexibilité des tissus. Les couches de fibres élastiques et de SMC se sont déformées plus du côté intimal que celles du côté adventitiel. De plus, il y avait un accord structurel dans l'angle d'alignement entre les noyaux SMC et les fibres élastiques sur leur côté intimal, mais pas sur le côté adventice. Il s'agit de la première étude dans laquelle les modifications de la microstructure de trois composants primaires de l'aorte ont été visualisées et évaluées à travers l'aorte. La méthode établie ici serait également utile pour comprendre la mécanique des tissus d'autres tissus mous porteurs.

La paroi aortique est caractérisée par trois couches, l'intima, la média et l'adventice. Parmi eux, les médias régissent principalement les comportements mécaniques de l'aorte et jouent un rôle central dans le remodelage fonctionnel ainsi que pathologique comme l'hypertension et l'athérosclérose. Le milieu est principalement constitué d'élastine, de collagène et de cellules musculaires lisses vasculaires (SMC), chacune ayant un module élastique à différents ordres. À savoir, les valeurs généralement acceptées pour le module de l'élastine, du collagène et du SMC sont respectivement d'environ 0,6 MPa1, 1 GPa1 et 1 à 100 kPa2. L'élastine et les SMC forment des couches alternées distinctes, les lamelles élastiques (EL) et la couche de muscle lisse (SML)3 dans la média, tandis que les fibres de collagène sont présentes dans les deux couches de la média et de l'adventice. Les lamelles élastiques sont composées d'élastine orientée circonférentiellement (71 % de l'élastine médiale totale), ayant de petites fenestrations dans une structure EL en forme de feuille4,5,6, et présentent une conformation ondulée à la fois dans la direction circonférentielle et axiale à l'état déchargé7,8,9. Cette hétérogénéité structurelle a entraîné un comportement mécanique viscoélastique non linéaire de l'aorte sous pressurisation intraluminale.

Le comportement mécanique de l'aorte est généralement décrit en deux phases10 : une grande déformation dans un domaine de basse pression et une petite déformation dans un domaine de haute pression. Dans la première phase dans la plage de basse pression, la paroi aortique se dilate radialement via l'étirement circonférentiel des fibres élastiques et le redressement des fibres de collagène ondulées, tandis que dans la deuxième phase dans la plage de haute pression, qui correspond à l'intérieur et au-dessus de la pression artérielle physiologique, la paroi aortique présente une expansion limitée car les fibres de collagène raides et redressées résistent aux contraintes mécaniques11. Au cours de la déformation des tissus, les CML sont également déformés principalement dans la direction circonférentielle12, ce qui pourrait être un déclencheur mécanique du fonctionnement des CML. Parce que la fonction artérielle est étroitement liée à la structure interne de la paroi artérielle, il est essentiel d'étudier l'altération de la microstructure artérielle au cours de la déformation macroscopique afin de comprendre les pathologies cardiovasculaires et les altérations conséquentes des fonctions et de la mécanique artérielles. Ces informations doivent être obtenues à partir d'expériences conservant la structure artérielle tridimensionnelle unique.

Des tentatives récentes de caractérisation tridimensionnelle des comportements mécaniques aortiques à l'aide d'explants d'aorte intacts ont démontré qu'une fraction de fibres de collagène restées ondulées était plus élevée dans les EL que dans les SML, même dans la plage de haute pression13, ce qui suggère que les SML sont plus étirés que les EL pendant la pressurisation. Cela peut entraîner un glissement de l'intercouche lors de la déformation circonférentielle14. Pendant ce temps, cette étude a également rapporté que les niveaux de contrainte dans les EL et les SML sont à des niveaux similaires, et qu'il n'y avait pas de différences statistiquement significatives dans les niveaux de contrainte des couches internes aux couches externes des EL ainsi que des SML. Ces résultats ont été obtenus à partir de l'aorte thoracique de la souris, probablement en raison d'une transmission limitée du laser à deux photons d'excitation à travers un spécimen d'aorte plus épais provenant d'animaux plus gros13,15. En conséquence, il est nécessaire d'étudier le comportement mécanique tridimensionnel de l'aorte de différents animaux modèles sous pressurisation intraluminale pour obtenir une compréhension globale de la biomécanique vasculaire, et pour y parvenir, une configuration expérimentale appropriée doit être établie.

La microscopie optique a été un outil puissant pour caractériser les comportements mécaniques des tissus mous biologiques, y compris les vaisseaux sanguins. Cependant, le microscope confocal à balayage laser conventionnel et même le microscope multiphoton ont une limitation de la profondeur qu'ils peuvent observer en raison d'une forte diffusion de la lumière et de l'absorbance des tissus biologiques (jusqu'à plusieurs dizaines à deux cents micromètres), et donc l'observation tridimensionnelle de l'intérieur profond du tissu a été difficile. Pour surmonter ces difficultés, des méthodes de compensation optique ont été proposées16. Bien que ces techniques aident à observer à travers un explant de tissu entier ou même une souris dans son ensemble17, cela impliquait la fixation des tissus et l'élimination de composants tissulaires spécifiques (par exemple, les lipides), résultant en des échantillons de tissus solidifiés, et n'était donc pas adapté à l'observation de la déformation des tissus mous sous une charge mécanique18,19. Récemment, une nouvelle méthode de compensation a été rapportée, qui est capable de maintenir la viabilité de l'embryon entier, des organoïdes ou même de petits animaux modèles pendant qu'il devient transparent20. En effet, cette méthode a réussi à éliminer le tissu tendineux dans notre étude précédente21. Dans la présente étude, nous avons adopté cette méthode de compensation dans la caractérisation mécanique tridimensionnelle de l'aorte thoracique du rat et avons observé avec succès des changements dans la structure de chacun des trois principaux composants de l'aorte sous pressurisation intraluminale, tout en prouvant le maintien de l'intégrité mécanique des tissus et de la flexibilité. La méthode établie ici conviendrait à la caractérisation mécanique tridimensionnelle non seulement des vaisseaux sanguins des grands animaux, mais également d'autres types de tissus mous porteurs.

Tout d'abord, nous avons confirmé comment le nettoyage des tissus améliore la visibilité de l'échantillon d'aorte avec une microscopie à deux photons. Dans l'aorte à l'état normal et non nettoyé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), nous n'avons pu obtenir que les images de l'EL le plus externe, correspondant à la profondeur tissulaire d'environ 60 µm à partir du haut de la surface de l'adventice (Fig. 1a). En revanche, après la compensation optique utilisant une solution d'iodixanol à 60% (Optiprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, USA) dans du PBS (solution de compensation), nous avons observé avec succès à travers la paroi aortique de l'adventice à l'intima qui existait à environ 90 µm de profondeur de la surface de l'adventice (Fig. 1a). Notez que les signaux fluorescents faibles des noyaux SMC dans les médias étaient attribuables au fait que ces SMC étaient probablement encore viables pendant la période de coloration.

(a) L'amélioration de la visibilité par la méthode de compensation des tissus. Un court segment de l'aorte thoracique du rat a été isolé et ouvert du côté dorsal, et le côté abdominal a été observé avec un microscope à deux photons de l'adventice vers l'intima dans un état normal et non dégagé dans du PBS (à gauche) et le même spécimen à l'état dégagé dans la solution de compensation (à droite). Les images présentées étaient les images de projection dans le plan radial-circonférentiel (r − θ) à partir des images initialement obtenues dans le plan axial-circonférentiel. L'autofluorescence de l'élastine (vert), le collagène SHG (bleu) et les signaux fluorescents des noyaux des cellules musculaires lisses (rouge) ont été fusionnés. Barres = 50 µm. (b) La préservation des microstructures de l'aorte thoracique du rat après le nettoyage optique. Les images en coupe dans le plan r - θ ont été obtenues à partir d'une aorte normale non dégagée (à gauche) et de la même aorte après le dégagement (à droite). Barres = 50 µm. Les images globales (en haut) sont les images fusionnées de l'autofluorescence de l'élastine (vert), du collagène SHG (cyan) et des signaux fluorescents des noyaux des cellules musculaires lisses (rouge). Les microstructures de chaque composant sont également présentées individuellement, qui sont des images agrandies d'une zone rectangulaire indiquée par des lignes brisées blanches dans chaque image globale. Les pointes de flèche indiquent une microstructure représentative dans chaque composant observé à la fois dans l'aorte normale et dégagée. Barres = 50 µm.

Nous avons également examiné si la méthode actuelle de compensation optique apportait des modifications structurelles à la paroi aortique. Il était évident que les microstructures des fibres d'élastine, des fibres de collagène et des cellules musculaires lisses étaient bien maintenues dans l'aorte dégagée (Fig. 1b). Il a également été observé que les lamelles élastiques ondulées devenaient relativement redressées et que les noyaux des cellules musculaires lisses devenaient étroits et allongés à l'état dégagé par rapport à l'état non dégagé, entraînant éventuellement une augmentation du diamètre extérieur de l'aorte dégagée. Les preuves coïncidaient bien avec les découvertes précédentes de préservation des organismes biologiques et des cellules avec la même méthode de nettoyage20 et prouvaient que la technique de nettoyage actuelle n'apportait aucun changement structurel remarquable.

Nous avons ensuite examiné si la méthode de compensation des tissus modifie le comportement mécanique de l'aorte avec un test pression-diamètre utilisant une configuration illustrée à la Fig. 2a. Dans la solution de compensation pendant le test, l'aorte est devenue transparente (Fig. 3), et il s'agissait d'un changement réversible. L'opacité de l'aorte dégagée a été déterminée comme étant de 0, 18 ± 0, 13 (moyenne ± SD, N = 3) (voir la Fig. S1 supplémentaire pour l'analyse). Il n'y avait pas de différences évidentes dans le comportement de déformation entre les spécimens d'aorte normaux non nettoyés testés dans du PBS et les spécimens d'aorte nettoyés testés dans la solution de nettoyage (Fig. 4). Dans toute la plage de pression intraluminale examinée, il y avait une tendance générale selon laquelle le diamètre de l'aorte à l'état dégagé était relativement plus grand que celui à l'état normal. Cependant, un changement non linéaire du diamètre était cohérent dans les deux conditions ; l'aorte a montré une faible déformabilité à une pression inférieure à 40 mmHg, une augmentation régulière du diamètre entre 40 et 80 mmHg et peu de changement de diamètre au-dessus de 100 mmHg (Fig. 4). Dans deux expériences, le spécimen a été replacé dans du PBS et stocké à 4 ° C après avoir été testé dans la solution de compensation, et le même protocole de test a été répété le jour suivant. Les relations pression-diamètre dans le PBS et la solution de compensation au jour 2 étaient similaires à celles obtenues le premier jour (Fig. S2 supplémentaire), démontrant la conservation de la structure tissulaire malgré le processus de compensation tissulaire.

Illustrations schématiques de la configuration expérimentale pour (a) le test pression-diamètre et (b) la microscopie dynamique à deux photons.

Photographies représentatives d'un spécimen d'aorte thoracique de rat soumis au test pression-diamètre. (a) L'échantillon a été testé dans du PBS, et (b) il a ensuite été clarifié et testé dans la solution de clarification. Notez que les nœuds noirs, faits pour la fermeture des artères intercostales, dans la face dorsale (l'arrière) étaient clairement visibles à travers l'aorte dégagée alors qu'ils étaient invisibles à l'état normal, non dégagé.

Relations pression-diamètre de l'aorte thoracique de rat testée à l'état normal dans du PBS et à l'état clair dans la solution de clairance.

Pour observer la déformation de la structure tissulaire à travers la paroi aortique sous l'application d'une pression intraluminale, un échantillon d'aorte a été dégagé et soumis à une microscopie multiphotonique dynamique à l'aide d'un appareil présenté sur la figure 2b. La distribution tridimensionnelle des fibres élastiques et des noyaux SMC dans les aortes dégagées a été clairement obtenue à l'aide de la microscopie multiphotonique, comme le démontrent les profils d'intensité du signal (Figs. 5, 6). Les fibres de collagène étaient également visibles sur toute l'épaisseur de la paroi aortique malgré une intensité de signal plus faible par rapport à l'élastine et aux noyaux des cellules musculaires lisses. La figure 6 montre la microstructure des fibres élastiques, la distribution des noyaux SMC et des fibres de collagène à chacun des EL et SML. Le pic et la variabilité de la distribution de l'angle d'alignement de chaque composant sur les images de la série de profondeur ont également été tracés à la Fig. 5. Les fibres élastiques, les noyaux SMC et les fibres de collagène ont tous suivi un profil de distribution d'angle similaire ; la majorité de ces composants étaient alignés à 90° (la direction circonférentielle), avec certaines couches alignées légèrement décalées de la direction circonférentielle (environ 30°). Lorsqu'une pression intraluminale a été appliquée, la quantité de la dispersion de la distribution de l'angle d'orientation est devenue plus petite. En effet, dans les EL et les SML, l'angle maximal de l'alignement global était constamment autour de 90° de 0 à 130 mmHg, la variabilité diminuant avec l'augmentation du niveau de pression (Fig. S3 supplémentaire). La dispersion a également été réduite avec l'augmentation de la pression dans les EL et les SML (Fig. S3 supplémentaire).

Profils d'intensité de signal représentatifs de l'autofluorescence de l'élastine, de la coloration du noyau SMC et du collagène SHG (en haut), et de l'angle d'alignement maximal de chaque composant (en bas) obtenu à travers l'aorte dégagée à une pression intraluminale de (a) 0 mmHg et (b) 70 mmHg. L'intensité du signal a été normalisée à l'intensité maximale de chaque composant respectif. L'angle d'alignement maximal (tracé avec des lignes pleines en bas) et la dispersion d'angle (équivalent à l'écart type, représenté sous forme de bandes) ont été déterminés à l'aide de la fonction de directionnalité dans ImageJ/Fiji. Le point zéro de l'axe horizontal correspondait au pic de la première EL (EL1). Les lignes brisées et pleines grises tracées verticalement indiquent la position en profondeur des pics locaux d'autofluorescence d'élastine et de fluorescence du noyau SMC, respectivement. L'angle maximal à 90° correspond à la direction circonférentielle de l'aorte.

Présentation couche par couche de la microstructure des EL, des SML et des fibres de collagène dans les EL et les SML visualisées dans l'aorte dégagée. Les axes de r, θ et z indiquent respectivement la direction radiale, circonférentielle et axiale. Des tranches uniques de la pile de profondeur d'EL, de collagène et de SML sur le plan θ - z sont présentées au milieu, présentant la microstructure des couches individuelles. L'image de EL et SML sur le plan r - θ (gauche et droite, respectivement) a été créée en projetant la pile d'images sur le plan θ - z sur le plan r - θ (tranches de somme pour EL et écart type pour SML, respectivement).

Nous avons également analysé si l'alignement des noyaux des cellules musculaires lisses était en accord avec l'alignement des fibres élastiques dans la couche d'élastine interne (côté intimal) ou externe (côté adventice) (Fig. 7). À la pression intraluminale de 40 mmHg, l'alignement des noyaux SMC était presque identique à l'alignement des fibres élastiques dans la couche interne, mais il n'était pas en accord avec l'alignement de l'élastine dans la couche externe (Fig. 7a). En effet, le coefficient de la régression était significativement plus élevé dans la relation entre SML et l'EL interne que celle entre SML et l'EL externe (P < 0,001). A 100 mmHg, la tendance était similaire à celle observée à 40 mmHg (Fig. 7b). La gamme des angles de pic est devenue plus petite à la fois dans les fibres élastiques et les noyaux SMC par rapport aux relations à 40 mmHg. L'alignement des noyaux SMC était bien en accord avec l'alignement des fibres élastiques dans l'EL interne mais mal corrélé avec l'alignement des fibres élastiques dans l'EL externe. Il a également été confirmé que le coefficient de régression était significativement plus élevé dans la relation entre SML et l'EL interne que celle entre SML et l'EL externe (P = 0,020).

Analyse de corrélation des angles de pic EL et des angles de pic SML. La corrélation a été calculée entre SML et son EL interne (à gauche) et entre SML et son EL externe (à droite). Les angles ont été obtenus au niveau de pression de (a) 40 mmHg et (b) 100 mmHg, respectivement. L'angle maximal à 90° correspond à la direction circonférentielle de l'aorte. N, nombre de spécimens ; n, le nombre total de paires de couches SML et EL analysées. L'analyse statistique a été effectuée pour n.

Lorsque l'aorte dégagée était pressurisée, il y avait une nette tendance à ce que les fibres élastiques et le SML dans les couches internes se déforment plus dans la direction circonférentielle que les couches externes (Fig. 8). Le niveau de la contrainte circonférentielle de l'EL le plus interne (EL1) était significativement plus grand que l'EL le plus externe (EL6) à tous les niveaux de pression examinés (P = 0,0006 à 40 mmHg, 0,0009 à 70 mmHg, 0,01 à 100 mmHg et 0,01 à 130 mmHg). Le niveau de souche EL1 était également significativement plus élevé que EL 3 à 40 mmHg (P = 0,01) et EL5 à 40 et 70 mmHg (P = 0,004 à 40 mmHg et 0,01 à 70 mmHg), respectivement. Le SML le plus interne (SML1) présentait un niveau de contrainte circonférentielle significativement plus élevé que SML4 à 40 mmHg (P = 0,039) et SML5 à 40 et 70 mmHg (P = 0,007 à 40 mmHg et 0,044 à 70 mmHg), respectivement. Le niveau de SML2 était également significativement plus élevé que SML5 à 40 mmHg (P = 0,023). Les niveaux de déformation des SML internes étaient également plus importants que ceux des SML externes à des niveaux de pression plus élevés, bien que les différences entre les couches ne soient pas statistiquement significatives.

Déformation circonférentielle (gauche) et axiale (droite) lors de la pressurisation dans chaque couche de (a) EL et (b) SML obtenues par microscopie dynamique à deux photons. PD dans le tracé de la déformation circonférentielle EL indique la déformation circonférentielle simplement calculée à partir des changements de diamètre apparent pendant les résultats du test pression-diamètre. N, nombre de spécimens. Une analyse statistique a été effectuée pour les données de souche indiquées entre parenthèses.

En revanche, il n'y avait pas de tendance aussi claire dans les niveaux de déformation des EL et des SML dans la direction axiale. Dans les EL et les SML, bien que les niveaux de déformation dans les couches externes soient légèrement supérieurs à ceux des couches internes, les amplitudes de la déformation axiale étaient nettement inférieures à celles de la déformation circonférentielle. Il n'y avait aucune différence statistiquement significative entre les couches à aucun des niveaux de pression examinés.

La souche de la couche de collagène (CL) a été analysée à tous les niveaux de pression dans un échantillon, car il s'agissait du seul échantillon pour lequel des images SHG de collagène ont été clairement obtenues sur toute l'épaisseur de la paroi aortique. La souche a été analysée dans les fibres de collagène en EL (CL(EL)) et celles en SML (CL(SML)) séparément, en utilisant la même méthode avec l'analyse de la souche EL. Il y avait une tendance générale selon laquelle la déformation circonférentielle dans les couches internes était supérieure à celle dans les couches externes (Fig. S4 supplémentaire), ce qui correspond aux tendances observées dans la déformation des EL et des SML.

Dans la présente étude, l'aorte thoracique de rat a été dégagée optiquement à travers sa profondeur tout en maintenant sa conformité mécanique, et le comportement tridimensionnel des tissus sous pressurisation intraluminale a été caractérisé. En particulier, la contrainte mécanique dans chaque couche de trois composants aortiques, à savoir l'élastine, les cellules musculaires lisses et le collagène, a été déterminée individuellement, révélant une déformation significativement plus importante de la lamelle élastique du côté intimal par rapport au côté adventice. À la connaissance des auteurs, il s'agit de la première étude à évaluer les modifications de la microstructure de trois composants primaires de l'aorte en réponse à la pressurisation tout en conservant sa structure cylindrique.

Dans la littérature, il existe plusieurs rapports d'observation à travers la paroi artérielle sans compensation optique à l'aide d'un modèle de souris22,23. Cependant, en cas d'aorte thoracique de rat, il était difficile de regarder à travers la paroi sans dégagement optique (Fig. 1a), probablement en raison d'une paroi plus épaisse chez le rat. Dans la présente étude, la méthode de compensation nous a permis d'observer les structures fines des fibres et des noyaux cellulaires à travers l'aorte en résolvant les décalages d'indice de réfraction et en calculant la souche à partir des images. Ainsi, le dégagement optique permet d'observer à travers la paroi des artères plus épaisses et d'obtenir des images microscopiques aux détails fins. La technique actuelle offre la possibilité d'étudier les détails des comportements mécaniques des vaisseaux sanguins plus grands que l'aorte thoracique de la souris.

Le diamètre de l'aorte a été légèrement augmenté lorsqu'il a été incubé dans la solution de compensation (Fig. 4), et cela pourrait être dû à un effet de déshydratation des tissus par la solution de compensation. Cependant, nous n'avons pas confirmé de changement statistiquement significatif du diamètre de l'aorte incubée dans des solutions salines hypertoniques, même dans une solution dont l'osmolalité est proche de la solution de compensation, sur une période de 6 h (Fig. S5 supplémentaire). En conséquence, cette petite augmentation du diamètre peut ne pas être uniquement due à la déshydratation des tissus. Cependant, il était évident que les EL étaient légèrement redressés et que les noyaux SMC devenaient étroits et allongés dans l'aorte dégagée par rapport à l'aorte non dégagée (Fig. 1b). Par conséquent, les propriétés physicochimiques de l'iodixanol, le soluté de la solution de compensation, peuvent influencer la structure de l'aorte et gonfler légèrement l'aorte, ce qui n'a cependant aucun impact significatif sur nos résultats expérimentaux et les conclusions de la présente étude.

L'une des découvertes importantes de la présente étude est que la déformabilité tissulaire de l'aorte dégagée était similaire à celle de l'aorte d'origine non dégagée ; l'aorte dans les deux états présentait une relation pression-diamètre non linéaire (Fig. 4). Un tel comportement mécanique sous pressurisation intraluminale a également été rapporté dans une étude précédente utilisant la même artère du même modèle animal24 ainsi que dans la même artère et d'autres artères chez d'autres espèces25,26. La coïncidence avec d'autres études valide non seulement les données mécaniques obtenues dans la présente étude, mais également l'utilisation de la méthode de compensation optique actuelle pour l'expérience de microscopie dynamique à deux photons.

La caractérisation du comportement aortique sous pression intraluminale a été tentée dans des études antérieures utilisant la microscopie à deux photons13,14,22,23,27 et le synchrotron à rayons X28. Cependant, les résultats obtenus se sont limités au comportement mécanique des composants tissulaires sélectionnés : modifications de l'angle d'orientation des fibres de collagène adventitielles sous pression 27, modifications de l'angle d'orientation des fibres de collagène médianes dans les EL et SML ainsi que les différences de degré de redressement des fibres de collagène entre EL et SML13, cisaillement entre EL et SML14 et dépliage des lamelles élastiques ondulées sous pression28. La présente étude se démarque de ces études en ce que l'alignement et la déformation des trois composants aortiques ont été analysés de la lamelle élastique la plus interne à la plus externe. Néanmoins, il convient de noter que l'intensité du signal SHG de collagène variait entre les échantillons, en particulier celui des fibres de collagène dans les EL et les SML du côté intimal (EL1-3 dans la présente étude). La raison possible en était l'absorption des signaux SHG par les fibres de collagène dans l'adventice. Nous avons gardé l'adventice en place car cela était nécessaire pour préserver la structure tissulaire d'origine de l'aorte afin de reproduire le comportement mécanique des tissus in vivo dans le cadre expérimental in vitro. Il était cependant très probable que les fibres de collagène adventitielles absorbaient les signaux SHG de collagène et empêchaient les signaux d'atteindre le détecteur. Comme l'autofluorescence de l'élastine et la fluorescence des noyaux cellulaires ont été observées avec succès même profondément à l'intérieur de la paroi aortique, le faisceau laser d'excitation à deux photons n'a pas été absorbé ou diffusé par les fibres de collagène adventitielles.

Il a été clairement démontré que les couches du côté intimal étaient plus déformées que celles du côté adventice (Fig. 8). Dans une étude précédente évaluant le remodelage de la paroi aortique à l'hypertension chez le rat, les CML du côté intimal sont devenus hypertrophiques dans une plus large mesure que ceux du côté adventitiel29. Nos résultats selon lesquels les EL du côté intimal (en particulier EL1) étaient remarquablement plus tendus dans une direction circonférentielle que ceux du côté adventice (en particulier EL6), et une tendance similaire observée dans les SML est bien pertinente pour les résultats précédents. Les preuves actuelles appuient la notion actuelle selon laquelle l'hypertension dans l'aorte applique une grande quantité de contrainte mécanique (dans la direction circonférentielle) aux CML du côté intimal, et les cellules réagissent à la contrainte accrue (et au stress associé) en s'adaptant structurellement pour maintenir la contrainte circonférentielle à un niveau physiologique.

Outre les différences inter-couches dans l'amplitude de la déformation, les différences inter-composants dans l'amplitude de la déformation ainsi que les modifications des angles d'alignement ont été évaluées. Cependant, nous n'avons pas trouvé de différences statistiquement significatives dans les amplitudes de déformation entre les trois composants de chaque couche (Fig. S6 supplémentaire), ni de changements significatifs dans l'angle d'alignement pendant le gonflage (Fig. S7 supplémentaire). En outre, une enquête approfondie sur les interactions entre les composants a été tentée, mais elle était difficile à réaliser à sa résolution d'image actuelle. On suppose que nous pourrions visualiser les mécanismes de stimulation in situ des SMC, car les stimulations de cisaillement par frottement entre leurs corps cellulaires et les fibres de collagène adjacentes peuvent se produire en raison de différentes amplitudes de contrainte locale entre les fibres de collagène et les SMC. Ces détails de l'environnement mécanique SMC seront une cible de nos travaux futurs.

Il était évident dans nos données de déformation (Fig. 8) que la déformation circonférentielle calculée à partir du changement de diamètre dans le test pression-diamètre (PD) était inférieure à celle calculée à partir de la microscopie dynamique à deux photons (EL1 – EL6). Cela fait suite à une distribution intra-muros théorique de la contrainte circonférentielle le long de la direction radiale dans un cylindre à paroi épaisse soumis à une pression interne. En d'autres termes, étant donné que le diamètre de l'aorte a été mesuré à partir des images de l'extérieur de l'aorte (Fig. 3), la mesure de la contrainte a été effectuée davantage à l'extérieur que EL6, ce qui a entraîné une valeur de contrainte inférieure à EL6. En outre, il convient de souligner que la contrainte EL locale a été mesurée du côté abdominal de l'aorte. Dans des études antérieures de la nôtre30 et d'autres31, l'étirement circonférentiel de l'aorte en réponse à la pressurisation intraluminale était plus important du côté abdominal que du côté dorsal. Étant donné que l'étirement circonférentiel global de l'aorte, qui équivaut à la souche PD dans la présente étude, peut être estimé comme une moyenne des souches ventrales et dorsales, la souche circonférentielle abdominale était environ 5 % plus grande que la souche circonférentielle globale. Dans la présente étude, la déformation circonférentielle EL6 était de 7 à 10 % supérieure à la déformation circonférentielle PD, ce qui correspondait essentiellement à ces résultats précédents. Étant donné que la contrainte EL6 a été mesurée à l'intérieur de l'aorte alors que la contrainte PD a été mesurée à partir de la surface radialement la plus externe de l'aorte, la contrainte EL6 pourrait être supérieure à la contrainte circonférentielle déterminée dans la surface la plus externe du côté abdominal de l'aorte. Cette différence dans la position radiale dans la mesure de la déformation a peut-être conduit à nos résultats selon lesquels la différence entre les souches EL6 et PD était relativement plus grande que les différences signalées entre les rapports d'étirement ventral et circonférentiel global. Il y avait également certains facteurs influençant la différence entre PD et EL6, tels que la différence dans la méthode de mesure de la contrainte (mesurée à partir de la structure de la fibre dans EL6 alors que mesurée à partir d'une taille globale de l'artère) et la méthode d'imagerie (microscope à deux photons vs stéréomicroscope).

Une autre découverte importante dans la présente étude était l'accord dans l'angle d'alignement du noyau des SMC et des fibres élastiques en dessous. Bien qu'il soit rapporté que les SMC s'ancrent aux EL à la fois sur leurs côtés intérieur et extérieur4,32, la préférence de l'alignement du noyau sur un côté des EL pourrait être pertinente pour le processus de développement de la structure de la paroi aortique. On pense que la structure aortique est formée par la formation d'une structure tubulaire par des cellules endothéliales, suivie d'un enroulement autour par des cellules mésenchymateuses33. Au fur et à mesure que les cellules se différencient en SMC, l'élastine est synthétisée et déposée entre les couches des cellules33. Parce que le côté intimal (intérieur) est déformé plus grand que le côté adventice (extérieur) avec la pression intraluminale, les cellules peuvent préférer construire une structure dans leur côté intérieur, renforcée avec des fibres alignées dans la direction de la déformation pour résister aux contraintes mécaniques. D'autres mécanismes, tels qu'une formation spontanée de la structure alignée des fibres élastiques, pourraient être possibles, car une structure laminaire tridimensionnelle, avec des fibres de collagène hautement organisées dans chaque couche, ne peut être formée qu'avec les molécules de collagène elles-mêmes via l'encombrement moléculaire34. Cependant, dans le développement de l'aorte, cela pourrait ne pas être le cas car les cellules mésenchymateuses s'accumulent avant leur synthèse d'élastine, et il pourrait donc n'y avoir aucun temps et/ou espace pour la formation d'alignement spontané de fibres élastiques.

Dans la microscopie dynamique à deux photons, le noyau cellulaire a été marqué par fluorescence avec de l'homodimère d'éthidium-III, qui marque les noyaux des cellules mortes. Ce colorant a été sélectionné en fonction de la séparation de la longueur d'onde de la lumière d'émission de l'échantillon ainsi que de la capacité de coloration. Cependant, la bonne colorabilité avec le marqueur de cellules mortes indique que les CML dans l'aorte dégagée n'étaient pas viables. Il est bien connu que l'état SMC entre contracté et détendu affecte de manière significative les comportements mécaniques des artères musculaires, mais seule une petite altération a été observée dans les comportements des artères élastiques, telles que l'artère carotide35. L'aorte de rat, utilisée dans la présente étude, est également classée comme une artère élastique. Par conséquent, bien que les SMC ne soient pas viables dans l'aorte dégagée, les comportements mécaniques de l'aorte dégagée sont réputés représenter étroitement les comportements de l'aorte normale non dégagée.

Il a été rapporté qu'une technique de compensation tissulaire influence la mécanique tissulaire36. Dans ce rapport, du PBS additionné de 80 % de propylène glycol (PG) a été utilisé pour la compensation optique de l'aorte porcine afin que le tissu soit déshydraté pour obtenir une transparence optique. Cette technique a également augmenté la rigidité de l'aorte. Étant donné que la compensation des tissus avec PG a été obtenue via l'élimination de l'eau diffusant la lumière des tissus et la déstabilisation de la structure du collagène d'ordre élevé par des agents chimiques dans la solution de compensation (c'est-à-dire PG) 37, des altérations du comportement mécanique étaient inévitables. Dans la présente étude, en revanche, nous avons utilisé une solution d'iodixanol à 60 % (Optiprep) dans du PBS comme solution de compensation, qui a une osmolalité estimée de 470 mOsm/L. Ceci était remarquablement inférieur à l'osmolalité estimée de 80 % de PG dans du PBS (11 000 mOsm/L)38. La supplémentation d'Optiprep dans le milieu vise à réduire une inadéquation des indices de réfraction entre les tissus/cellules sous imagerie et le milieu pour l'imagerie20, mais pas à induire une déshydratation des tissus pour obtenir la transparence des tissus. En effet, il a été démontré que l'aorte porcine restait opaque lorsqu'elle était incubée dans une solution de PG à 30 %36 (estimée à 4000 mOsm/L38). Par conséquent, la déshydratation induite par l'osmolalité par notre solution de compensation est supposée être très faible et insuffisante pour rendre l'aorte de rat claire. Nos résultats ont également reflété le fait que les comportements mécaniques de l'aorte de rat nettoyée étaient similaires à ceux de l'aorte normale (Fig. 4), suggérant peut-être un petit effet de la méthode de compensation actuelle sur la mécanique des tissus. La stratégie de déshydratation des tissus peut être appropriée pour les spécimens épais optiquement clairs comme l'aorte porcine, et donc, ce sera un sujet de recherche intéressant dans une étude future pour comparer les méthodes de compensation des tissus pour les grands spécimens d'aorte.

L'une des limites de la présente étude est que nous n'avons pas examiné si la compensation des tissus affecte les réponses mécaniques de l'aorte, en particulier au niveau de la microstructure. Bien que nous ayons confirmé que le dégagement tissulaire n'apportait aucune altération marquée de la structure de l'aorte à l'état non chargé (Fig. 1) et des comportements mécaniques macroscopiques (Fig. 4), ces résultats ne confirment pas que les réponses microstructurales sont également les mêmes entre l'aorte normale et l'aorte dégagée. Par conséquent, une étude future devrait être menée pour résoudre ce problème.

En conclusion, nous avons établi un modèle expérimental de caractérisation du comportement mécanique aortique à travers l'épaisseur du tissu par dégagement optique, tout en maintenant la compliance tissulaire. Il a été confirmé que l'amplitude de la déformation circonférentielle des lames élastiques dépendait fortement de l'emplacement dans la paroi aortique, et l'orientation des cellules musculaires lisses est bien en accord avec celle des fibres élastiques situées sur leur côté intimal.

Un total de 8 rats mâles Wistar (âgés de 8 à 9 semaines) ont été utilisés dans la présente étude. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par l'Institutional Review Board for Animal Care de la Graduate School of Engineering de l'Université de Nagoya (numéro d'approbation 18-8) et ont été réalisées conformément au Guide for Animal Experimentation de l'Université de Nagoya ainsi qu'aux directives ARRIVE39. Un animal a été acheté à la fois plusieurs jours avant l'expérience et gardé dans une cage individuelle jusqu'au sacrifice. Tous les rats ont été maintenus sur un cycle d'éclairage diurne régulier (12:12 lumière: obscurité) avec un accès ad libitum à la nourriture (CLEA Rodent Diet CE-2) et à l'eau. Un système de rinçage automatique a été utilisé pour garder la cage propre. Les animaux ont été logés dans une animalerie spécialement désignée, ventilée et maintenue à 25 ° C tout au long de l'année, et ont été autorisés à effectuer des activités quotidiennes normales. Aucune analgésie n'a été fournie aux rats avant le sacrifice. Les comportements des animaux ont été soigneusement vérifiés chaque jour et aucune anomalie évidente n'était évidente chez tous les animaux avant l'utilisation dans les expériences. Les expériences ont été conçues pour garder l'utilisation minimale des animaux.

Les animaux ont été sacrifiés avec du gaz carbonique et la section tubulaire de l'aorte thoracique, d'une longueur in vivo d'environ 40 mm, a été obtenue de chaque rat immédiatement après le sacrifice. La longueur in vivo entre les positions de coupe proximale et distale a été enregistrée afin de reproduire la longueur physiologique dans les expériences in vitro décrites ci-dessous (un rapport d'étirement moyen de 1,4). L'aorte isolée a été placée dans du PBS tandis que les tissus mous faiblement connectés entourant la surface aortique, y compris la graisse, ont été soigneusement retirés tout en maintenant l'adventice en place.

Une courte section longitudinale a été prélevée sur une aorte isolée et ouverte sur la face dorsale. L'échantillon a été incubé dans 5 µM d'éthidium homodimère-III (Biotium, États-Unis) dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C pour colorer les noyaux des cellules musculaires lisses et a été imagé sous un microscope à deux photons (A1R MP, Nikon, Japon) dans un état normal non éclairci dans le PBS. Le spécimen rectangulaire a été placé à plat avec l'adventice de la face abdominale vers le haut. Des images sur le plan axial-circonférentiel (z - θ) ont été obtenues de l'adventice vers l'intima avec un objectif à immersion dans l'eau 25 × et un laser d'excitation à une longueur d'onde de 860 nm. L'élastine a été imagée par son autofluorescence avec un filtre 525/50. Les signaux de fluorescence des noyaux des cellules musculaires lisses ont été obtenus avec un jeu de filtres 575/25. Les fibres de collagène ont été visualisées en collectant des signaux de génération de deuxième harmonique (SHG) à partir de molécules de collagène avec un tube photomultiplicateur équipé d'un ensemble de filtres 492SP. Une série d'images en profondeur, chacune composée de 512 × 512 pixels couvrant une région carrée de 510 µm, a été obtenue à une vitesse de 0,5 ips avec une moyenne de 2 × avec un intervalle de 1 µm jusqu'à ce que la structure fibreuse de l'élastine soit indétectable. L'échantillon a ensuite été clarifié dans la solution de clarification et imagé à nouveau de la même manière dans la solution de clarification. Les images obtenues ont été projetées sur un plan radial-circonférentiel (r - θ) (projection de l'écart type) pour démontrer la profondeur de visibilité dans chaque condition.

Un échantillon en forme d'anneau avec une longueur axiale de 1 mm a été préparé à partir d'une autre aorte de rat isolée en coupant dans un plan transversal à l'axe longitudinal de l'aorte. Après le marquage fluorescent des noyaux de cellules musculaires lisses dans l'échantillon avec 5 µM d'homodimère d'éthidium-III (Biotium) dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C, l'échantillon a été imagé au microscope à deux photons (Nikon) dans un état normal non dégagé dans du PBS. Images sur le plan radial-circonférentiel (r - θ) capturant toutes les couches de fibres d'élastine, de cellules musculaires lisses et de fibres de collagène comme décrit ci-dessus. Une série d'images en profondeur, chacune composée de 512 × 512 pixels couvrant une région carrée de 347 µm, a été obtenue à une vitesse de 0,5 ips avec une moyenne de 2 × avec un intervalle de 0,5 µm jusqu'à ce que les signaux deviennent indétectables. L'échantillon a ensuite été clarifié dans la solution de clarification et imagé à nouveau d'une manière similaire dans la solution de clarification.

Pour caractériser le comportement mécanique de l'aorte avec/sans dégagement tissulaire, un test pression-diamètre a été réalisé sur trois animaux. Chaque extrémité de l'échantillon d'aorte était attachée à un gabarit creux en acier inoxydable sur mesure et connectée à un dispositif de test (Fig. 2a) similaire à ceux utilisés dans les études précédentes13,14, avec la face abdominale tournée vers le haut (Fig. 3). La longueur de la section d'essai était d'au moins 20 mm. Le test a été réalisé à température ambiante tandis que l'échantillon était maintenu dans un bain de l'appareil rempli de PBS. La pression intraluminale a été fournie à l'aide d'une pompe à main et contrôlée avec un manomètre à mercure (Navis, Japon). Les images de l'aorte ont été capturées avec une caméra CCD (coupled-charged device) (DFC310, Leica, Allemagne) équipée d'un stéréomicroscope (M165 FC, Leica). L'échantillon a été étiré à sa longueur in vivo, et 10 cycles de gonflage et dégonflage avec du PBS entre 0 et 200 mmHg ont été appliqués comme préconditionnement. Cela a été suivi d'un cycle unique d'inflation et de déflation; l'image de l'aorte a été capturée à chaque incrément de pression de 20 mmHg pendant le gonflage et à chaque réduction de 20 mmHg pendant le dégonflage pour l'analyse des données. Le spécimen a été détaché du dispositif de test et placé dans la solution de compensation pendant 2 h à température ambiante jusqu'à ce que l'aorte soit complètement dégagée. Le protocole de test a été effectué à nouveau, avec le spécimen maintenu dans la solution de compensation (Fig. 3). La série de tests a été réalisée le jour même du prélèvement de l'aorte.

Trois autres animaux ont été utilisés pour la microscopie dynamique à deux photons. L'échantillon d'aorte a été prélevé comme décrit ci-dessus et les noyaux cellulaires ont été colorés avec de l'homodimère d'éthidium-III (biotium) dissous à 5 µM dans du PBS pendant 1 h à température ambiante sur une bascule. L'échantillon a ensuite été clarifié dans la solution de clarification contenant 5 µM d'homodimère d'éthidium-III pendant une nuit à 4 °C sur une bascule. Pour l'observation microstructurale de l'aorte pendant la pressurisation intraluminale, l'échantillon a été attaché au même dispositif de test utilisé pour le test pression-diamètre monté sur une platine motorisée du microscope à deux photons (Nikon), avec la face abdominale tournée vers le haut et étiré à la longueur in vivo. Le système a été légèrement modifié pour la microscopie multiphotonique (Fig. 2b). L'aorte a été maintenue dans le bain rempli de la solution de compensation et la pression intraluminale a été appliquée sous forme de pression hydrostatique en modifiant la hauteur d'un réservoir (seringue de 25 ml) rempli de solution saline saturée. La solution saline dans le réservoir et la solution de compensation dans l'échantillon étaient connectées via une seule bulle d'air introduite dans le circuit d'écoulement. Le niveau de pression a été contrôlé avec un transducteur de pression (DX-100, Nihon Koden, Japon) situé à l'extrémité de l'échantillon opposée à l'extrémité se connectant au réservoir.

Dix cycles de gonflage et de dégonflage de l'aorte par l'application de la pression intraluminale entre 0 et 160 mmHg ont été réalisés en préconditionnement. Cela a été suivi d'une application en série de 0, 40, 70, 100 et 130 mmHg sur l'échantillon ; des images microscopiques ont été capturées à chaque étape de pression comme suit. Pour caractériser les altérations de la structure microscopique de l'aorte au cours de la pressurisation, trois composants majeurs de l'aorte, à savoir l'élastine, les cellules musculaires lisses et le collagène, ont été imagés simultanément dans toute la paroi aortique, de la couche d'élastine intimale la plus interne à la couche de collagène adventice la plus externe. Une série de profondeur composée d'un total de jusqu'à 200 images a été capturée avec un intervalle de 0,67 ou 1 µm; chaque image, d'une taille de 512 × 512 pixels couvrant une région carrée de 347 µm, a été obtenue à une vitesse de 0,5 fps avec une moyenne de 2 ×. L'intensité du laser et la sensibilité du photomultiplicateur à chaque canal ont été ajustées pour éviter le halo.

Dans les images microscopiques obtenues, les altérations de l'alignement des fibres élastiques dans chaque lamina élastique et des noyaux de cellules musculaires lisses dans chaque couche musculaire lisse ont été évaluées ; deux échantillons sur trois présentaient une faible intensité SHG de collagène, et l'analyse de l'alignement des fibres de collagène n'a donc pu être effectuée qu'avec un seul échantillon. Pour identifier les régions représentatives dans chaque EL et SML à chaque étape de pression, une région carrée de 256 × 256 pixels a été recadrée à partir de l'ensemble des images de la série de profondeur de EL et SML, qui ont fourni les pics et les creux les plus distinctifs dans le profil de l'intensité moyenne du signal de chaque tranche d'image le long de la position en profondeur (Fig. 5). La position en profondeur de chacun des 6 pics pour EL et 5 pics pour SML a été identifiée, et la tranche de profondeur correspondante a été sélectionnée comme image représentative de chacun de EL et SML et utilisée pour une analyse ultérieure.

L'alignement des fibres élastiques et des noyaux des cellules musculaires lisses a été évalué sur les images de la série de profondeur ainsi que dans les images EL et SML sélectionnées à l'aide de la fonction Directionality dans ImageJ/Fiji (version 2.1.0, NIH, USA). Cela a effectué une transformée de Fourier rapide bidimensionnelle (2D-FFT), et la fonction de densité de probabilité de la distribution gaussienne a été ajustée à la distribution angulaire des fibres/noyaux élastiques dans les images. De l'analyse, trois paramètres décrivant leur orientation ont été obtenus : le pic (degré) et la dispersion (sans unité) de la fonction de distribution de probabilité ajustée ainsi que la qualité de l'ajustement (une valeur sans unité comprise entre 0 et 1). Parmi les trois paramètres, nous avons utilisé la valeur maximale comme angle d'alignement représentatif des fibres élastiques/noyaux cellulaires. De plus, les changements dans un angle d'alignement de pic global et moyen des EL et des SML dans un échantillon d'aorte entier ont été évalués en calculant et en comparant simplement la moyenne et l'écart type du pic et la dispersion de tous les EL et SML de deux échantillons à chaque étape de pression.

Pour évaluer la déformation de chacun des réseaux de fibres EL, SML et de collagène dans EL et SML, une analyse de déformation basée sur l'image a été effectuée. À partir de la pile de profondeur pleine grandeur de chaque composant à chaque étape de pression, des images de sous-pile ont été recueillies couvrant toute l'épaisseur de chaque couche ; la position en profondeur de chaque couche a été déterminée par inspection visuelle des images du plan r - θ (radial-circonférentiel) reconstruites à partir des images originales de la pile de profondeur du plan z - θ (axial-circonférentiel). Toutes les images de chaque sous-pile ont été additionnées pour créer une image projetée, et un total de 5 images projetées (correspondant à 0, 40, 70, 100 et 130 mmHg) ont été empilées.

Pour définir des marqueurs de contrainte, des objets caractéristiques dans chaque pile d'images, traçables tout au long de la série de piles, ont été sélectionnés manuellement autour de la ligne centrale horizontale des images. Dans les images EL, ces éléments caractéristiques étaient des points lumineux dans le réseau de fibres élastiques ; il s'agissait de noyaux cellulaires typiques dans SML. Pour la déformation circonférentielle, deux marqueurs positionnés approximativement aux mêmes emplacements horizontaux sur la ligne médiane horizontale ont été appariés. La distance entre les marqueurs appariés a été enregistrée à chaque étape de pression, et la déformation nominale pour la direction circonférentielle a été calculée. Au moins trois paires de marqueurs ont été utilisées pour mesurer la déformation dans chaque pile. De même, deux marqueurs positionnés approximativement aux mêmes emplacements verticaux ont été appariés et utilisés pour la détermination de la déformation axiale.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du langage statistique R (ver. 4.3.0). Les comparaisons entre plus de deux groupes ont été effectuées à l'aide du test de Kruskal-Wallis, suivi du test de comparaison multiple de Steel-Dwass si une signification statistique a été trouvée dans le test de Kruskal-Wallis. Dans la comparaison de la distribution des angles d'alignement, le test de Dunnett a été utilisé, en prenant les données de 0 mmHg comme contrôle. La signification de la différence entre deux corrélations indépendantes a été évaluée à l'aide du package R cocor40 et les statistiques z de Fisher ont été calculées. Dans tous les tests, le seuil de signification a été fixé à P < 0,05.

Les ensembles de données générés et analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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La présente étude a été soutenue en partie par JSPS KAKENHI (Nos. 18K12028, 15H05860, 18H03752, 19K22960), JSPS Platforms for Advanced Technologies and Research Resources "Advanced Bioimaging Support" (JP16H06280) et AMED-CREST Grant number JP19gm0810005. Les auteurs tiennent à remercier la Division du génie de la recherche médicale de l'École supérieure de médecine de l'Université de Nagoya pour l'utilisation du microscope à deux photons (A1RMP, Nikon).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Eijiro Maeda et Yoriko Ando.

Laboratoire de biomécanique, Département de génie des systèmes mécaniques, École supérieure d'ingénierie, Université de Nagoya, Furo-cho, Chikusa-ku, Nagoya, Aichi, 464-8603, Japon

Eijiro Maeda, Yoriko Ando, ​​Kazuhiro Takeshita & Takeo Matsumoto

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EM a mené des expériences, analysé les données et préparé le manuscrit. YA a conceptualisé l'étude, conçu et mené des expériences, puis collecté et analysé les données. KT a mené des expériences et collecté les données. TM a conceptualisé l'étude, analysé les données et finalisé le manuscrit. EM et YA ont contribué à parts égales à cette étude.

Correspondance à Takeo Matsumoto.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Maeda, E., Ando, ​​Y., Takeshita, K. et al. A travers l'aorte dégagée : caractérisation tridimensionnelle des comportements mécaniques de l'aorte thoracique de rat sous pressurisation intraluminale à l'aide de la méthode de dégagement optique. Sci Rep 12, 8632 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12429-5

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Reçu : 09 décembre 2021

Accepté : 09 mai 2022

Publié: 23 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-12429-5

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