Klotho à Osx+

Transduction du signal et thérapie ciblée volume 7, numéro d'article : 155 (2022) Citer cet article

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Les défauts osseux maxillo-faciaux sont couramment observés en pratique clinique. Une meilleure compréhension du réseau de régulation dirigeant la formation osseuse maxillo-faciale favorisera le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour la régénération osseuse. La voie de signalisation du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) est essentielle au développement de l'os maxillo-facial. Klotho, une protéine transmembranaire de type I, est un composant important des complexes récepteurs FGF. Des études récentes ont rapporté la présence de l'expression de Klotho dans l'os. Cependant, le rôle de Klotho dans le développement et la réparation craniosquelettiques reste inconnu. Ici, nous utilisons une stratégie génétique pour signaler que la suppression de Klotho dans les progéniteurs mésenchymateux positifs pour Osx entraîne une réduction significative de l'ostéogenèse dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les progéniteurs mensenchymateux déficients en klotho suppriment également l'ostéoclastogenèse in vitro et in vivo. Dans des conditions d'inflammation et de perte osseuse induite par un traumatisme, nous constatons que Klotho exerce une fonction inhibitrice sur la signalisation TNFR induite par l'inflammation en atténuant l'expression de Rankl. Plus important encore, nous montrons pour la première fois que Klotho est présent dans l'os alvéolaire humain, avec un schéma d'expression distinct dans des conditions normales et pathologiques. En résumé, nos résultats identifient le mécanisme par lequel Klotho exprimé dans les progéniteurs Osx+-mensenchymateux contrôle la différenciation des ostéoblastes et l'ostéoclastogenèse lors de la formation et de la réparation de l'os alvéolaire mandibulaire. La signalisation médiée par Klotho est un élément important du remodelage et de la régénération de l'os alvéolaire. Il peut également être une cible pour de futures thérapeutiques.

L'os maxillo-facial a des fonctions physiologiques cruciales, telles que la formation de la charpente faciale, la protection des systèmes digestif et respiratoire et le soutien des tissus mous et des structures dentaires adjacents.1 Les défauts osseux dans la région maxillo-faciale sont souvent observés en pratique clinique. Les causes les plus fréquentes sont l'inflammation, les traumatismes, le cancer buccal et les malformations congénitales.2 Le traitement des malformations et de la régénération osseuse a toujours été difficile en raison de ses caractéristiques uniques, des exigences esthétiques du squelette facial et des changements physiques importants qui peuvent entraîner une détresse psychosociale.3 Il existe des différences évidentes entre l'os maxillo-facial et la plupart des autres os en raison de leur origine embryonnaire, de leur formation osseuse et de leur structure.4 défauts osseux.

La voie de signalisation du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) est essentielle au développement de l'os maxillo-facial. Les murations des gènes humaines dans les récepteurs FGF ont été identifiées comme des causes de plusieurs anomalies dans la croissance et le développement du squelette craniofacial.5 klotho (KL) est une protéine transmembranaire de type I qui est un composant essentiel du récepteur FGF 1 (FGFR1). GF23) car il augmente la capacité de liaison de FGFR1 à FGF23. Le FGF23 est une hormone sécrétée principalement par les ostéocytes et les ostéoblastes et sert à maintenir l'homéostasie des ions minéraux.7 Le Klotho est principalement exprimé dans les reins, la glande parathyroïde et le plexus choroïde. était due à un défaut fonctionnel cellulaire autonome de Klotho dans les os ou à des changements systémiques dus à l'hyperphosphatémie et à l'hypervitaminose D. Une autre étude a utilisé Prx1Cre pour éliminer conditionnellement Klotho dans les cellules souches mésenchymateuses. Les souris Prx1Cre;KLfl/fl ont révélé un phénotype squelettique comparable aux témoins ; mais ces souris ne pouvaient pas augmenter l'expression de FGF23 dans le squelette dans des conditions urémiques.10 Depuis la découverte de Klotho dans les ostéocytes,9 Komaba et al. ont démontré que l'ablation de Klotho spécifique aux ostéocytes entraînait une augmentation frappante de la formation osseuse associée à une activité accrue des ostéoblastes.11 L'écart dans le phénotype squelettique de ces modèles de souris était peut-être dû à un rôle distinct de Klotho dans différentes populations de cellules osseuses.

En raison des lignées embryonnaires spécifiques et du schéma de développement, la majeure partie du squelette craniofacial provient des cellules de la crête neurale et est formée par une ossification intramembraneuse et endochondrale, tandis que le squelette du membre est le produit de cellules mésodermiques de la plaque latérale et subit une formation osseuse endochondrale. Par conséquent, la fonction de Klotho peut varier selon les régions du squelette. Il est à noter que les patients atteints de maladies génétiques telles que la calcinose tumorale, qui est associée à une mutation faux-sens dans Klotho, souffrent de graves anomalies craniofaciales,13 soulignant le rôle essentiel de Klotho dans le développement de l'os craniofacial. Cependant, la fonction régulatrice de Klotho dans l'ossification osseuse maxillo-faciale ainsi que dans la pathogenèse de la perte et de la réparation osseuse maxillo-faciale reste inconnue.

Dans cette étude, nous avons généré un nouveau modèle de souris avec une ablation ciblée de Klotho dans des cellules progénitrices mésenchymateuses Osterix+ (Osx+) pour étudier ces questions. L'inactivation de Klotho chez les progéniteurs Osx+ a provoqué des déformations du squelette, y compris une diminution de la formation d'os alvéolaire mandibulaire et une diminution de la résorption osseuse. Cela a conduit à un volume osseux alvéolaire anormalement élevé au cours du développement. De plus, nous avons découvert les mécanismes de régulation utilisés par Klotho exprimé par les progéniteurs mésenchymateux pour affecter l'ostéoclastogenèse. Nous avons constaté qu'en réponse à la perte osseuse alvéolaire et aux lésions traumatiques, Klotho joue un rôle essentiel dans la promotion de l'ostéogenèse pendant la réparation osseuse tout en inhibant la résorption osseuse induite par l'inflammation en ciblant la signalisation du facteur de nécrose tumorale et l'expression de Rankl. De plus, nous avons signalé pour la première fois la présence de Klotho dans l'os alvéolaire humain et son profil d'expression distinct dans des conditions saines et pathologiques.

Nous avons étudié un rôle possible de Klotho dans le développement de l'os maxillo-facial en supprimant conditionnellement l'expression de Klotho dans les progéniteurs mésenchymateux exprimant Osx. Cela a été accompli en croisant des souris KLfl / fl avec des souris OsxCre (Fig. 1a, b supplémentaires). Les souris OsxCre; KLfl / fl sont nées avec le taux attendu d'hérédité mendélienne et avaient un poids corporel similaire à celui des souris témoins (Fig. 1c supplémentaire). Les taux sériques de Ca2 +, Pi et FGF23 intact n'ont pas été modifiés chez les souris OsxCre; KLfl / fl, ce qui nous a permis d'isoler la fonction tissu-spécifique de Klotho (Fig. 1e supplémentaire). La coloration au rouge alizarine / bleu alcian n'a pas détecté de changements significatifs de la minéralisation squelettique dans l'os craniofacial des souris néonatales OsxCre; KLfl / fl (Fig. 1f supplémentaire). À 3 semaines après la naissance, l'analyse μCT a révélé un volume d'os alvéolaire comparable dans la zone de furcation des premières molaires mandibulaires chez les souris OsxCre;KLfl/fl et les témoins (Fig. 1a). Les mutants présentaient une augmentation légère mais non significative du volume osseux / volume tissulaire (BV / TV,%, p = 0, 180) et une diminution de la séparation trabéculaire (Tb.Sp, μm, p = 0, 051) (Fig. 1b). Nous avons observé un volume d'os alvéolaire significativement plus élevé chez ces souris knock-out conditionnelles à un stade ultérieur par rapport aux témoins de la même portée (Fig. 1c). L'analyse quantitative μCT a révélé une BV/TV significativement plus élevée (p = 0,012) et une épaisseur trabéculaire (Tb.Th, mm, p = 0,020) chez les mutants par rapport aux autres membres de la même portée. Aucune différence n'a été observée dans Tb.Sp (p = 0,170) (Fig. 1d). Nous avons également effectué une coloration H&E de l'os mandibulaire de souris âgées de 3 et 11 semaines. Sans surprise, la masse osseuse trabéculaire dans la zone de la furcation était plus élevée chez les souris OsxCre;KLfl/fl. Aucun changement n'a été observé dans l'histologie des molaires mandibulaires (Fig. 1e, f).

Le déficit en Klotho dans les cellules Osx+ entraîne une altération du remodelage osseux. a, c Reconstruction tridimensionnelle à partir de tomodensitométries de l'os alvéolaire de souris OsxCre;KLfl/fl et de leurs compagnons de litière témoins à 3 (a) et 11 semaines (c). b, d Analyses quantitatives du volume osseux/volume tissulaire (BV/TV, %), de l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th, μm) et de la séparation trabéculaire (Tb.Sp, μm) chez les souris 3- (b, n = 5 dans le groupe OsxCre et n = 8 dans le groupe OsxCre ; KLfl/fl) et les souris âgées de 11 semaines (d, n = 3). e, f Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) de l'os alvéolaire à la bifurcation de la racine de la 1ère molaire mandibulaire chez des souris âgées de 3 (e) et 11 semaines (f). Des grossissements plus élevés des zones encadrées montrent une augmentation de la masse osseuse alvéolaire chez les souris OsxCre;KLfl/fl. n = 5. g, h Double marquage à la calcéine de l'os alvéolaire des souris témoins et OsxCre;KLfl/fl. Image représentative (g) et analyses quantitatives du taux de formation osseuse/surface osseuse (BFR/BS, μm3/μm2/jour), du taux d'apposition minérale (MAR, μm/jour) et de la surface de minéralisation/surface osseuse (MS/BS, %) (h). n = 8. i Double coloration par fluorescence de RUNX2 et OSX:GFP. Des grossissements plus élevés des zones encadrées montrent une distribution cellulaire positive pour RUNX2 et OSX: GFP à la bifurcation de la racine de la 1ère molaire. j, k Quantification de RUNX2 ou OSX : cellules GFP-positives/ostéoblastes totaux chez des souris âgées de 3 (j) et 11 semaines (k). n = 6 dans le groupe OsxCre et n = 4 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl. l Coloration TRAP. Des grossissements plus élevés des zones encadrées montrent que le nombre de cellules TRAP-positives a diminué chez les souris OsxCre;KLfl/fl. m Quantification des cellules/surface osseuse TRAP-positives chez des souris âgées de 3 (à gauche) et de 11 semaines (à droite). n = 4 dans le groupe OsxCre et n = 5 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl. n Analyse qRT-PCR de la transcription Acp5, Mmp9, Rankl, Opg et Rankl/Opg chez des souris âgées de 11 semaines. n = 4 dans le groupe OsxCre et n = 6 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barre d'échelle, 1 mm (a, c), 200 μm (e), 50 μm (g, i) et 100 μm (l)

L'augmentation du volume osseux alvéolaire chez les souris Klotho-ablation pourrait résulter d'un déséquilibre de la formation et de la résorption osseuse. Par conséquent, nous avons effectué une histomorphométrie dynamique sur l'os alvéolaire. Les résultats ont montré que la surface minérale / surface osseuse (MS / BS), le taux d'apposition minérale (MAR) et le taux de formation osseuse / surface osseuse (BFR / BS) étaient nettement régulés à la baisse chez les souris OsxCre; KLfl / fl par rapport aux témoins (Fig. 1g, h). Ensuite, nous avons déterminé les activités des cellules de la lignée des ostéoblastes par coloration immunofluorescente. Alors que le nombre de cellules positives pour le facteur de transcription lié à Runt 2 (Runx2) était inchangé chez les souris mutantes, la suppression de Klotho réduisait considérablement l'immunoréactivité d'Osx (Fig. 1i-k). En général, Runx2 définit les cellules progénitrices engagées dans le préostéoblaste, tandis que l'expression d'Osx signifie la différenciation en ostéoblaste. Ces résultats suggèrent que l'ablation de Klotho a principalement affecté l'activité et la maturation des ostéoblastes.

La coloration à la phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP) a révélé une diminution significative des ostéoclastes / de la surface osseuse positifs pour TRAP dans l'os alvéolaire des souris OsxCre; KLfl / fl par rapport aux témoins du même âge (Fig. 1l, m). En outre, les gènes liés à la différenciation et à l'activation des ostéoclastes, tels que Acp5 (Trap) et la métalloprotéinase matricielle 9 (Mmp9), ont été nettement supprimés chez les mutants. Nous avons ensuite évalué les facteurs clés sécrétés par les ostéoblastes pour médier la résorption osseuse et avons constaté une réduction de l'activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire κ B (Rankl), une augmentation de l'expression de l'ostéoprotégérine (Opg) et une diminution du rapport Rankl / Opg dans l'os alvéolaire, ce qui implique un effet dépendant du progéniteur mésenchymateux Klotho sur l'ostéoclastogenèse (Fig. 1n).

Nous avons établi une fonction essentielle de Klotho dans le développement de l'os alvéolaire in vivo, nous avons donc ensuite exploré comment la perte de Klotho inhibait l'ossification. Nous avons isolé l'ARN total des mandibules de souris OsxCre;KLfl/fl et OsxCre et l'avons soumis à un séquençage d'ARN (RNA-seq). Le transcriptome global a été significativement modifié entre les souris témoins et les souris Klotho-ablées. Sur un total de 26 758 gènes exprimés, 510 gènes ont été régulés à la hausse tandis que 432 gènes ont été régulés à la baisse dans les mandibules appauvries en Klotho (Fig. 2a). Les régulateurs cruciaux associés à l'ostéogenèse, tels que la phosphoprotéine acide 1 de la matrice dentinaire (Dmp1), la phosphoprotéine sécrétée 1 (Spp1), le collagène de type I alpha 2 (Col1α2) et l'ostéomoduline (Omd), se sont avérés significativement supprimés chez les mutants (Fig. 2b). De même, l'analyse de l'ontologie des gènes (GO) a montré que les gènes régulés à la baisse par le déficit en Klotho étaient fortement exprimés au cours du développement du système squelettique, de l'ossification, du développement des tissus biominéraux, etc. (Fig. 2c).

Klotho favorise le développement du système squelettique en favorisant la différenciation ostéogénique. un diagramme de Venn montrant 510 gènes régulés positivement de manière unique tandis que 432 gènes régulés négativement dans les mandibules ablatées par Klotho (valeur p <0, 05). n = 3. b Carte thermique des gènes représentatifs associés à l'ostéogenèse. Le rouge indique une expression régulée à la hausse ; le bleu indique une expression régulée à la baisse. c Analyse d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) des gènes régulés négativement dans les gènes exprimés différentiellement totaux (DEG). d Coloration à la phosphatase alcaline (ALP) et coloration au rouge alizarine (ARS), respectivement, à 7 jours (7j) et 14 jours d'induction ostéogénique dans les ostéoblastes crâniens primaires de souris OsxCre et OsxCre;KLfl/fl. n = 3. e Transcription de Osx, Runx2, Alp, Dmp1, Col1α1 et Rankl après induction 14j. n = 3. f Coloration ALP et ARS après transfection de particules de lentivirus pour surexprimer Klotho (OE) ou charge vide (NC). n = 3. g Transcription des gènes après 14 jours d'induction. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM

Nous avons poursuivi notre enquête sur le rôle de Klotho à partir de précurseurs Osx + dans la médiation de l'ostéogenèse in vitro. Des ostéoblastes de souris OsxCre et OsxCre;KLfl/fl ont été cultivés. Après 7 et 14 jours de culture dans des conditions ostéogéniques, les ostéoblastes supprimés de Klotho présentaient une diminution significative de l'intensité de la coloration de la phosphatase alcaline (ALP) et du rouge alizarine (ARS), accompagnée de marqueurs ostéogéniques régulés à la baisse, notamment Osx, Runx2, la phosphatase alcaline (Alp), Dmp1 et le collagène de type I alpha 1 (Col1α1), indiquant une diminution de la différenciation ostéogénique (Fig. 2d, e). En revanche, les ostéoblastes de KLfl/fl ont été transfectés par des lentiviraux pour surexprimer Klotho et cultivés dans des milieux ostéogéniques. La surexpression de Klotho entraîne une augmentation marquée des intensités d'ALP et d'ARS, accompagnée de niveaux d'expression plus élevés de marqueurs liés à l'ostéogenèse (Fig. 2f, g). Ces données impliquent que Klotho améliore le développement du squelette craniofacial en accélérant la différenciation ostéogénique des cellules Osx+.

Les données ci-dessus indiquent que Klotho dans les ostéoblastes est important pour la formation osseuse alvéolaire mandibulaire. Nous avons donc déterminé si la suppression de Klotho affecterait la perte osseuse pathologique in vivo. Nous avons d'abord établi un modèle standard de parodontite apicale (AP). À cette fin, la pulpe dentaire des premières molaires mandibulaires chez les souris OsxCre;KLfl/fl et témoins a été exposée au microenvironnement oral. μCT a révélé qu'une perte osseuse alvéolaire significative a été trouvée dans la première molaire mandibulaire des souris OsxCre;KLfl/fl et contrôle 3 semaines après l'induction du modèle. Étonnamment, les souris OsxCre; KLfl / fl AP ont montré une zone radiotransparente plus profonde caractérisée par une zone de lésion périapicale et un facteur de motif trabéculaire significativement accrus (Tb.Pf, 1 / μm) ainsi qu'une racine dentaire raccourcie par rapport au groupe témoin AP (Fig. 3a, b, Fig. 2a, b supplémentaires). L'examen histologique a montré que les souris OsxCre;KLfl/fl et les souris témoins avaient conservé des structures périapicales dans des conditions normales. La PA a conduit à une infiltration de cellules inflammatoires entourant l'apex des dents affectées, accompagnée d'une augmentation de la résorption osseuse alvéolaire (Fig. 3c). L'analyse de l'expression génique a démontré que l'AP provoquait une augmentation des niveaux d'expression du facteur de nécrose tumorale-α (Tnf-α) et de l'interleukine-6 (IL-6) par rapport aux témoins (Fig. 3d).

La suppression de Klotho favorise la lésion périapicale dans l'os alvéolaire. a Images μCT de la première molaire mandibulaire d'OsxCre; KLfl/fl et de souris témoins dans des groupes de parodontite apicale et fictive. La flèche rouge représente la lésion périapicale. b Analyse quantitative de la zone de lésion périapicale comprenant la zone périapicale (mm3) et le diamètre périapical (μm), n = 5 ; et les paramètres de l'os spongieux, y compris BV/TV (%), Tb.Th (μm), facteur de motif trabéculaire (Tb.Pf, 1/μm) et Tb.Sp (μm), n = 6 dans le groupe OsxCre Sham et AP, n = 7 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl Sham et n = 8 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl AP. c La coloration H&E des mandibules représente la lésion périapicale induite par la parodontite apicale. La ligne pointillée montre l'étendue de la lésion périapicale. n = 5. d Expression de la transcription de Tnf-α et Il-6 dans l'os périapical. n = 5. e, f Coloration TRAP et quantification des cellules/surface osseuse TRAP-positives. Des grossissements plus élevés des zones encadrées montrent plus de cellules TRAP-positives dans la région de la lésion des souris OsxCre;KLfl/fl. n = 3. g Coloration par immunofluorescence pour RANKL dans la région périapicale. Les zones encadrées montrent une expression plus élevée de RANKL dans le groupe OsxCre;KLfl/fl AP. Les lignes pointillées jaunes représentent l'interface de la racine distale de la 1ère molaire. h Expression génique de Rankl, Opg et rapport Rankl/Opg dans l'os périapical de la 1ère molaire mandibulaire. n = 4 dans le groupe OsxCre Sham et OsxCre;KLfl/fl AP, n = 5 dans le groupe OsxCre-AP et n = 3 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl Sham. i Double coloration par immunofluorescence d'OSX:GFP et tdTomato dans l'os périapical entourant la racine distale de la 1ère molaire mandibulaire. Les zones encadrées montrent des grossissements plus élevés des cellules doublement positives OSX: GFP et tdTomato dans l'os périapical. La pointe de flèche blanche indique les cellules doublement positives. j Quantification des cellules doublement positives OSX:GFP et tdTomato. n = 4 dans le groupe OsxCre-sham, n = 13 dans le groupe OsxCre-AP, n = 8 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl-sham et n = 12 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl-AP. *, $, #p < 0,05, **, ##p < 0,01, ***, ###p < 0,001, ****, ####p < 0,0001, * indique AP versus sham, $ indique OsxCre Sham versus OsxCre;KLfl/fl Sham, # indique OsxCre AP versus OsxCre;KLfl/fl AP. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barre d'échelle, 200 μm (a, c), 100 μm (e) et 50 μm (g, i)

Il convient de noter que les souris avec ablation de Klotho présentaient un nombre d'ostéoclastes nettement accru et des racines dentaires plus gravement perturbées que les souris témoins, ce qui suggère que la résorption osseuse est élevée dans la perte osseuse inflammatoire en l'absence de Klotho (Fig. 3e, f). Il convient également de noter que les lésions AP montrent une expression élevée de Rankl pour la différenciation des ostéoclastes. En effet, dans le site de lésion AP, les souris OsxCre; KLfl / fl avaient une expression de Rankl augmentée par rapport aux souris témoins, ce qui était cohérent au niveau de la transcription (Fig. 3g, h). Pendant ce temps, l'expression d'Opg a été réduite lors de l'inflammation, conduisant au rapport Rankl / Opg le plus élevé chez les souris Klotho-ablées avec AP (Fig. 3h). La perte osseuse est auto-limitée dans la plupart des cas de PA, en raison d'un équilibre nouvellement établi entre la résorption osseuse et la formation osseuse.16 Par conséquent, nous avons ensuite examiné si une déficience en Klotho affecterait ce processus de régulation protecteur pendant la PA. Nous avons généré des souris témoins et mutantes qui expriment le gène tdTomato afin de visualiser les cellules de la lignée Osx+ au cours de la progression de la perte osseuse périapicale induite par l'infection. Les cellules exprimant Osx et leur progéniture évaluées par l'expression de tdTomato induite par OsxCre ont été abondamment détectées dans la pulpe dentaire, le ligament parodontal, ainsi que les ostéoblastes et les ostéocytes dans l'os alvéolaire (Fig. 3i). Le double marquage immunofluorescent de tdTomato et GFP a montré que l'AP induisait de manière significative la génération de cellules Osx: GFP +, qui étaient également tdTomato + (Fig. 3j). Cela suggère que le microenvironnement apical pathologique préserve dans une certaine mesure la capacité de formation des tissus durs en augmentant la différenciation ostéogénique. Plus important encore, une réduction significative des cellules doublement positives Osx: GFP / tdTomato a été détectée chez les mutants, ce qui implique le potentiel ostéogénique altéré des cellules dépourvues de Klotho.

Nous avons également évalué la fonction de Klotho dans la réparation de l'os alvéolaire en générant un modèle de cicatrisation de l'alvéole alvéolaire. La reconstruction μCT volumétrique 3D a révélé que la cicatrisation osseuse au site d'extraction était complète chez les souris témoins 21 jours après l'extraction dentaire. Cependant, les mutants avaient une surface osseuse moins organisée et une cicatrisation retardée de la cavité alvéolaire (Fig. 4a). L'os régénéré occupant le site de cicatrisation a ensuite été évalué. Il y avait une diminution significative de la BV/TV et de la densité minérale osseuse (DMO) dans l'os nouvellement formé des souris OsxCre;KLfl/fl. Aucune différence n'a été observée dans la surface osseuse/le volume osseux (BS/BV), le nombre trabéculaire (Tb. N) et la Tb. Sp chez les mutants (Fig. 4b). Les souris OsxCre;KLfl/fl avaient moins d'os alvéolaire interconnecté dans l'alvéole d'extraction, accompagné d'une augmentation de la zone de moelle osseuse (Fig. 4c). Le remodelage osseux après extraction dentaire est accompli par la coordination des ostéoblastes et des ostéoclastes,17 nous avons donc ensuite énuméré les ostéoclastes à la surface de l'os. Il y avait de nombreux ostéoclastes attachés à la surface osseuse des alvéoles de cicatrisation dans les deux groupes. Cependant, le nombre d'ostéoclastes par périmètre osseux a augmenté de manière significative chez les souris OsxCre; KLfl / fl (Fig. 4d, e). Le double marquage immunofluorescent a montré une réduction statistique des ostéoblastes positifs pour Runx2 dans les cellules déficientes en klotho autour de l'os trabéculaire dans l'alvéole. De même, moins d'ostéoblastes GFP + / tdTomato + ont été détectés chez les souris déficientes en Klotho par rapport aux témoins (Fig. 4f, g), ce qui suggère que la suppression de Klotho a conduit à une différenciation ostéoblastique supprimée lors d'une blessure traumatique. Pris ensemble, ces résultats indiquent que les alvéoles d'extraction plus lentes à guérir chez les souris OsxCre;KLfl/fl pourraient être dues à une réduction de l'ostéogenèse accompagnée d'une résorption osseuse accélérée.

La réparation osseuse alvéolaire est atténuée chez les souris OsxCre;KLfl/fl. a, b Images μCT et analyses quantitatives de la cicatrisation osseuse dans l'alvéole d'extraction dentaire. Les ellipses blanches indiquent l'alvéole d'extraction au maxillaire. La pointe de flèche bleue indique le retard de cicatrisation de l'alvéole dentaire. n = 3 dans le groupe OsxCre et n = 5 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl. c–e Coloration H&E et TRAP de l'alvéole d'extraction dentaire des souris témoins et OsxCre;KLfl/fl. Des grossissements plus élevés des zones encadrées montrent moins de réparation osseuse et plus de cellules TRAP-positives dans la douille des souris OsxCre;KLfl/fl. n = 3 dans le groupe OsxCre et n = 6 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl. f La coloration par immunofluorescence RUNX2 et le double marquage par fluorescence de OSX: GFP et tdTomato montrent une réduction des ostéoblastes positifs pour Runx2 ou OSX: GFP et tdTomato chez les souris Klotho-deletion. g Quantification des cellules positives RUNX2 ou des cellules doublement positives OSX: GFP et tdTomato dans la prise. n = 4 dans le groupe OsxCre et n = 7 dans le groupe OsxCre;KLfl/fl. *p < 0,05, **p < 0,01. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barre d'échelle, 500 μm (a), 200 μm (c), 100 μm (d) ou 50 μm (f)

Les modèles de parodontite apicale et d'extraction dentaire générés pour cette étude ont confirmé l'effet néfaste de la suppression de Klotho sur la réparation tissulaire en médiant à la fois l'activité des ostéoblastes et des ostéoclastes. Le mécanisme par lequel la déficience de Klotho dans les cellules de la lignée des ostéoblastes médie la résorption osseuse a été étudié à l'aide d'ostéoblastes dérivés de calvaria co-cultivés avec des ostéoclastes dérivés de la moelle osseuse. Klotho a été enlevé en administrant de la Cre médiée par un adénovirus (Ad-CRE) à des ostéoblastes obtenus à partir de souris KLfl / fl (Fig. 5e). Les ostéoblastes déficients en klotho ont démontré une capacité réduite à soutenir l'ostéoclastogenèse, comme l'indique le nombre réduit de cellules multinucléées TRAP + (Fig. 5a, b). Nous avons effectué un essai de résorption de la fosse dans un système de co-culture ostéoblastes-ostéoclastes pour déterminer l'activité des ostéoclastes. Conformément aux résultats de la coloration TRAP, les ostéoclastes de la co-culture avec des cellules ostéoblastiques déficientes en Klotho avaient une activité de résorption réduite par rapport aux ostéoblastes témoins (Fig. 5c, d). Nous avons recherché les facteurs clés sécrétés par les ostéoblastes pour ajuster l'activité des ostéoclastes et avons constaté que l'expression de Rankl était régulée à la baisse dans les ostéoblastes après ablation de Klotho alors qu'elle était régulée à la hausse dans les cellules présentant une surexpression de Klotho (Fig. 2e, g). De plus, Rankl a été régulé à la baisse après avoir été transfecté par Ad-CRE dans des ostéoblastes de souris KLfl / fl (Fig. 5f). Ces données ont démontré que le Klotho ostéoblastique agit de manière non autonome pour la médiation de la différenciation et de l'activité des ostéoclastes.

L'ostéoblaste-Klotho médie la formation des ostéoclastes et supprime l'activation du récepteur I du TNF induite par le TNF-α. a – d Les ostéoblastes primaires de souris KLfl / fl ont été transfectés avec Cre médiée par l'adénovirus (Ad-CRE), Ad-GFP a été utilisé comme contrôle. Ostéoblastes transfectés et macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM) co-cultivés sous TNF-α ou traitement par véhicule. a, b Coloration TRAP et analyses quantitatives après 9 jours d'induction. n = 3. c, d Essai de résorption de la fosse après 13 jours d'induction. n = 4. e Expression génique de Klotho dans les ostéoblastes de souris KLfl/fl après transfection d'adénovirus. n = 6. f Transcription du gène lié à l'ostéoclastogenèse Rankl. n = 3. g Les cellules MC3T3 surexprimées par Klotho ont été traitées avec du TNF-α (10 ng/mL, 60 min) ou un véhicule suivi d'une puce pour Klotho. L'ADN a été quantifié par qPCR et les résultats ont été présentés sous forme d'enrichissement par rapport aux IgG témoins. n = 3. h GO analyse d'enrichissement des gènes régulés positivement dans les DEG. n = 3. i Expression génique de Tnfr1 dans le modèle AP de OsxCre;KLfl/fl et souris témoins. n = 6 dans les groupes OsxCre-sham et OsxCre-AP et n = 3 dans les groupes OsxCre;KLfl/fl-sham et OsxCre;KLfl/fl AP. j Immunocytochimie de Klotho et TNFR I dans les progéniteurs surexprimés de Klotho. k L'immunocytochimie montre la distribution de NF-κB p65 dans le cytoplasme et le noyau. l Quantification de l'expression du TNFR I lors de la stimulation par le TNF-α. n = 4 dans les groupes NC-CTRL et OE (Klotho Overexpression)-TNF-α ; n = 6 dans les groupes NC-TNF-α et OE-CTRL. m Quantification de la translocalisation nucléaire de NF-κB p65. n = 3 dans les groupes NC-Vehicel et NC-TNF-α ; n = 4 dans les groupes OE-Véhicule et OE-TNF-α. n Expression génique de Rankl dans les ostéoblastes primaires et les ostéoblastes délétés de Klotho lorsqu'ils sont traités avec le TNF-α en association avec le R-7050 (inhibiteur du TNFR I). n = 3. o Un test de co-immunoprécipitation a été réalisé sur des cellules MC3T3 surexprimées par Klotho. Les protéines ont été recueillies et immunoprécipitées avec des anticorps Klotho ou TNFR I. Western blot a été réalisé en utilisant des anticorps Klotho ou TNFR I pour déterminer l'interaction entre Klotho et TNFR I. Immunoprécipitation IP. *, $, †p < 0,05, **, ##, §§p < 0,01, ***,$$$, §§§p < 0,001, ****, ####p < 0,0001, * indique AP versus simulacre, ou Véhicule versus TNF-α. $ indique OsxCre Sham versus OsxCre;KLfl/fl Sham, ou NC Vehicle versus OE Vehicle. # indique Ad-GFP Vehicle versus Ad-CRE Vehicle, OsxCre AP versus OsxCre;KLfl/fl AP, ou NC-TNF-α versus OE-TNF-α. § indique TNF-α versus TNF-α + R-7050. † indiquent Ad-GFP TNF-α + R-7050 versus Ad-CRE TNF-α + R-7050. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barre d'échelle, 100 μm (a, c) et 50 μm (j, k)

Les défauts osseux maxillo-faciaux peuvent être causés par plusieurs facteurs, notamment l'inflammation et les traumatismes.2 L'une des caractéristiques communes de l'inflammation et de la perte osseuse induite par les traumatismes est l'activation de la signalisation TNF.18 Pour explorer cet aspect, le TNF-α a été introduit dans le système de co-culture ostéoblastes-ostéoclastes afin d'examiner l'effet du déficit en Klotho sur la réponse inflammatoire et l'ostéoclastogenèse. Le TNF-α a amplifié la différenciation des ostéoclastes induite par les ostéoblastes dans les groupes témoins et mutants. L'ostéoclastogenèse a été atténuée dans les ostéoblastes cultivés déficients en Klotho dans des conditions normales, mais étonnamment, il y a eu une augmentation encore plus significative du nombre et de l'activité des ostéoclastes dans les co-cultures de cellules ostéoblastiques Klotho-ablées lors de l'administration de TNF-α (Fig. 5a – d). Cela s'est accompagné d'une expression de Rankl plus élevée indiquant que Klotho pourrait jouer un rôle central dans la suppression de Rankl induite par la signalisation du TNF-α dans les ostéoblastes et la formation ultérieure d'ostéoclastes au cours de l'inflammation (Fig. 5f). En outre, ChIP-qPCR a été appliqué pour détecter si Klotho pouvait se lier à la région régulatrice indiquée de Rankl. Le traitement des ostéoblastes surexprimés de Klotho avec du TNF-α a révélé que Klotho était associé de manière inductible à l'élément régulateur distal de -140 kB Rankl, indiquant que Klotho pouvait présenter une fonction nucléaire pour réprimer la transcription de Rankl sous inflammation (Fig. 5g).

L'analyse GO des gènes des mandibules appauvries en Klotho a montré que les gènes régulés positivement étaient associés à la régulation de la réponse au stimulus externe, à la régulation de la réponse inflammatoire et à la voie de signalisation médiée par le facteur de nécrose tumorale (Fig. 5h). En effet, des niveaux d'expression plus élevés du récepteur majeur du TNF-α, le récepteur I du TNF (Tnfr1), ont été observés chez les souris OsxCre;KLfl/fl, le niveau le plus élevé étant détecté chez les souris OsxCre;KLfl/fl sous AP. Ceci est une autre indication que Klotho peut influencer négativement la réponse inflammatoire (Fig. 5i). Pour tester cette hypothèse, nous avons d'abord surexprimé Klotho dans les ostéoblastes et avons trouvé une expression significativement supprimée de TNFR I dans la cytomembrane dans des conditions normales (Fig. 5j). L'examen par immunofluorescence des ostéoblastes témoins traités avec le TNF-α a révélé une expression plus élevée du TNFR I par rapport à un groupe traité avec le véhicule. Pourtant, cette régulation positive a été émoussée par la surexpression de Klotho (Fig. 5l). De plus, la surexpression de Klotho a supprimé de manière significative la translocalisation nucléaire de la sous-unité NF-κB p65 induite par le TNF-α, entraînant une réduction des ostéoblastes activés au nombre total d'ostéoblastes par rapport aux cellules témoins également soumises au TNF-α (Fig. 5k, m). Le R-7050 est un inhibiteur de TNFR à petite molécule qui bloque l'association de TNFR I avec des molécules adaptatrices intracellulaires, telles que TRADD et RIP.19 Notamment, l'administration de R-7050 a empêché l'expression de Rankl induite par le TNF-α et cela s'est produit sans l'impact de l'ablation de Klotho, démontrant que Klotho affectait le TNFR I lui-même plutôt que ses molécules en aval sous stimulation par le TNF-α (Fig. 5n). Pour étudier plus avant la possibilité d'une interaction entre Klotho et TNFR I, des tests de co-immunoprécipitation ont été effectués. Les résultats ont indiqué que Klotho pouvait se lier directement au TNFR I, ce qui pourrait interférer avec la voie de signalisation du TNFR I (Fig. 5o).

L'expression de Klotho a été identifiée dans une variété de tissus humains, tels que les reins, le placenta, les poumons, le pancréas, le sein, la glande parathyroïde, le cœur, le système vasculaire, le cerveau et plusieurs tissus endocriniens. Nous avons examiné l'expression de Klotho dans le tissu osseux alvéolaire humain en recueillant des échantillons d'individus normaux et de patients atteints de PA. L'immunomarquage a démontré que KLOTHO était fortement exprimé dans la membrane cellulaire et le cytoplasme des ostéoblastes et des ostéocytes de l'os alvéolaire dans des conditions physiologiques normales (Fig. 6b). Dans des états pathologiques, la coloration H&E a montré que le tissu osseux était entouré de cellules liées à l'inflammation concomitantes avec davantage d'ostéoclastes TRAP-positifs autour du tissu osseux (Fig. 6a). Plus important encore, le pourcentage de cellules KLOTHO-positives était nettement élevé avec l'AP, ainsi qu'une tendance à l'augmentation de l'expression des gènes (Fig. 6b, c). La transcription élevée de Klotho a également été observée chez des souris avec AP et extraction dentaire (Fig. 3 supplémentaire). Curieusement, nous avons observé que l'expression de la protéine KLOTHO était localisée dans le noyau cellulaire chez les patients AP, suggérant une fonction nucléaire potentielle pour Klotho dans des conditions inflammatoires (Fig. 6d).

L'os alvéolaire humain dans la parodontite apicale est associé à un schéma d'expression altéré de Klotho. une coloration H&E et TRAP d'individus sains et de patients AP. b Coloration par immunofluorescence et quantification des cellules KLOTHO-positives dans l'os alvéolaire humain. n = 8 chez les individus sains ou 12 chez les patients AP. c Expression génique de KLOTHO dans l'os alvéolaire d'individus sains et de patients AP. n = 4 chez les individus sains et n = 7 chez les patients AP. d Les images 3D obtenues par microscopie confocale montrent le schéma d'expression de la protéine KLOTHO. n = 4. e Le diagramme schématique a montré que Klotho chez les progéniteurs Osx+-mensenchymateux exerce des effets pro-ostéogéniques et anti-inflammatoires lors de la formation et de la réparation de l'os mandibulaire. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Barre d'échelle, 100 μm (a), 50 μm (b) et 10 μm (c)

Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que Klotho chez les progéniteurs mensenchymateux joue un rôle clé dans la formation et la réparation de l'os alvéolaire mandibulaire en favorisant directement la différenciation ostéogénique et en régulant l'ostéoclastogenèse d'une manière non cellulaire autonome. Plus important encore, le Klotho ostéoblastique a une fonction centrale dans la suppression de la perte osseuse induite par l'inflammation (Fig. 6e). Le modèle d'expression distinct de Klotho dans l'os alvéolaire humain dans des conditions physiologiques et pathologiques normales ouvre des voies pour moduler l'expression de Klotho dans les progéniteurs mensenchymateux afin de stimuler la formation et la régénération de l'os alvéolaire.

Ici, nous avons généré un nouveau modèle murin de suppression spécifique d'Osx de Klotho qui démontre une fonction essentielle pour Klotho dans la régulation de la formation et de la réparation de l'os alvéolaire mandibulaire. Les souris OsxCre;KLfl/fl ont présenté une réduction de la formation d'os alvéolaire au cours des stades de développement et adultes. De plus, l'analyse ARN-seq a révélé que l'expression des gènes liés à l'ostéogénèse était significativement régulée à la baisse dans les mandibules mutantes. Cela suggère que Klotho exprimé dans les cellules exprimant Osx fonctionne pour stimuler l'ostéogenèse pendant la formation de l'os alvéolaire mandibulaire. La différenciation ostéogénique altérée chez les mutants est similaire à celle observée chez les souris Klotho-hypomorphes, qui présentent un nombre réduit d'ostéoblastes et une ostéopénie.22 Hikone et al. ont trouvé une altération du ligament parodontal et de l'os alvéolaire mandibulaire chez des souris kl/kl. Les anomalies de l'os alvéolaire comprenaient moins d'ostéoblastes ALP + et d'ostéoclastes TRAP +, qui étaient similaires à ceux trouvés chez les souris OsxCre; KLfl / fl.23 Cependant, chez les souris kl / kl, le métabolisme minéral gravement perturbé rend difficile l'interprétation dans quelle mesure la perturbation de l'expression de Klotho dans les cellules osseuses explique le phénotype squelettique de manière cellulaire autonome. En effet, les tissus parodontaux anormaux du septum interalvéolaire des souris kl/kl pourraient être sauvés en administrant un régime pauvre en Pi.23 Dans cette étude, l'homéostasie systémique des ions minéraux chez les souris OsxCre;KLfl/fl n'a pas été affectée, ce qui nous a permis de disséquer le rôle tissu-spécifique de Klotho. La culture in vitro d'ostéoblastes primaires de souris OsxCre; KLfl / fl et OsxCre a confirmé en outre que la perte de Klotho supprime la différenciation ostéogénique, indiquant un rôle cellulaire autonome de Klotho dans la régulation de la formation osseuse alvéolaire. De plus, le FGF23 exprimé dans les ostéoblastes, les ostéocytes, les cémentoblastes et les odontoblastes dans les mandibules, ce qui était fortement corrélé au développement des ostéoblastes et à la minéralisation de la matrice.24 Les fonctions de signalisation locales Klotho/FGF23 dans la médiation des tissus parodontaux et du développement de l'os alvéolaire.23,24 et les compagnons de portée témoins (Fig. 1d, e supplémentaires), suggérant que Klotho peut fonctionner de manière indépendante de la signalisation FGF. De plus, l'ablation de Klotho entraîne une différenciation supprimée des cellules progénitrices mésenchymateuses Osx + dans la réponse de réparation. La différenciation ostéogénique réduite des progéniteurs mensenchymateux déficients en Klotho semblait contradictoire avec le phénotype des souris à délétion Klotho spécifiques aux ostéocytes, qui ont une activité ostéoblastique et un taux de formation osseuse régulés à la hausse. contre la formation osseuse intramembraneuse. Par exemple, l'os craniofacial se développe à partir de la migration des cellules de la crête neurale crânienne, ce qui est distinct de la formation des os longs.25 Plusieurs facteurs de croissance, récepteurs et leurs voies de signalisation en aval ont diverses fonctions dans le squelette axial et appendiculaire par rapport à l'os craniofacial.4 Le phénotype squelettique différent observé chez les souris OsxCre;KLfl/fl met en évidence le rôle spécifique de Klotho lors de la formation de l'os alvéolaire mandibulaire. L'exemple clinique le plus notable est celui des patients atteints de calcinose tumorale, une mutation faux-sens homozygote de Klotho, accompagnée de phénotypes orofaciaux sévères, tels qu'une ostéopénie diffuse et une sclérose inégale dans les calvaires ainsi que des racines raccourcies.13 Ce dernier a également été observé chez les souris OsxCre;KLfl/fl sous AP, mettant en évidence les mécanismes de régulation distinctifs de Klotho à travers différents composants squelettiques.

Il est important de noter que la suppression de Klotho dans les progéniteurs Osx + mésenchymateux réduisait considérablement l'ostéoclastogenèse. Nous avons observé une réduction significative des ostéoclastes chez les souris OsxCre;KLfl/fl, accompagnée d'une expression supprimée des marqueurs liés aux ostéoclastes. Ce phénotype est similaire à celui des souris Klotho-hypomorphes, qui présentaient un nombre réduit d'ostéoblastes et d'ostéoclastes et une épaisseur d'os cortical plus faible.

Le volume osseux alvéolaire global chez les souris OsxCre;KLfl/fl a été relativement augmenté. Cela était dû à une ostéoclastogenèse nettement supprimée, qui a dépassé la réduction de l'ostéogenèse. Ce déséquilibre dans la formation osseuse et la résorption osseuse a finalement conduit à un volume osseux alvéolaire étonnamment élevé chez les souris OsxCre;KLfl/fl. Cette découverte est conforme à plusieurs autres observations qui ont montré une augmentation du volume osseux trabéculaire chez les souris kl/kl accompagnée d'un faible renouvellement. Il convient de noter qu'à l'âge de 3 semaines, la suppression de Klotho n'a pas affecté de manière significative le volume osseux alvéolaire, bien qu'il y ait eu une diminution du nombre d'ostéoblastes et d'ostéoclastes. Cela pourrait être dû au jeune âge des souris que nous avons analysées, le phénotype se développant au fil du temps à mesure que les souris progressaient vers le stade adulte.

L'homéostasie osseuse adulte normale repose sur un équilibre entre l'activité des ostéoblastes et des ostéoclastes. Le rôle principal des ostéoblastes est de déposer la matrice osseuse, mais ils synthétisent et sécrètent également des molécules paracrines pour se coordonner avec l'ostéoclastogenèse. observé chez les souris OsxCre;KLfl/fl. La co-culture d'ostéoblastes et d'ostéoclastes suggère que les ostéoblastes déficients en Klotho, accompagnés d'une expression de Rankl plus faible, n'ont pas réussi à stimuler l'ostéoclastogenèse in vitro. Cela indique que la diminution de la résorption osseuse observée chez les mutants est le résultat direct de la suppression fonctionnelle de Klotho chez les progéniteurs Osx+-mésenchymateux. Bien que Klotho spécifique aux ostéoclastes ait également favorisé l'ostéoclastogenèse induite par Rankl, 26 les souris OsxCre; KLfl / fl avaient une ablation conditionnelle de Klotho chez les progéniteurs Osx + mais pas chez les ostéoclastes, ce qui suggère que Klotho est impliqué dans la résorption osseuse dépendante des ostéoblastes, au moins en partie, par la régulation de Rankl dans les ostéoblastes. Il a été suggéré que dans les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, la liaison de RANKL à RANK active la signalisation RANKL, qui régule négativement la différenciation des ostéoblastes.32 Nous proposons que la réduction de la formation osseuse chez les souris OsxCre;KLfl/fl soit principalement causée par la suppression de l'expression d'autres facteurs liés à l'ostéogénèse. L'expression de Rankl dans les cellules Osx+ chez les souris OsxCre;KLfl/fl est essentielle pour la médiation de l'ostéoclastogenèse.

Une autre découverte intéressante dans cette étude est que la résorption osseuse est activée chez les souris OsxCre;KLfl/fl en conjonction avec la perte osseuse liée à l'inflammation et les lésions osseuses traumatiques malgré l'ostéoclastogenèse réprimée observée dans l'état physiologique normal. Il est à noter que le nombre d'ostéoclastes et les niveaux de Rankl/Opg étaient plus élevés chez les souris Prx1Cre;KLfl/fl pendant l'inflammation urémique,27 indiquant que Klotho dans les progéniteurs mésenchymateux peut médier l'ostéoclastogenèse dans des conditions pathologiques. Bien que la parodontite apicale soit une pathologie osseuse destructrice et que la cicatrisation osseuse après extraction dentaire soit un processus régénératif, les deux impliquent la régulation de l'inflammation. au traumatisme et aux insultes bactériennes.36 Diverses cytokines, telles que le TNF-α, l'interleukine-1, l'interleukine-6 et la chimiokine motif 2 (CCL2), sont fortement exprimées au stade inflammatoire.18 En particulier, la cytokine pro-inflammatoire TNF-α joue un rôle crucial lors de la résorption osseuse et de la cicatrisation osseuse. Il stimule l'ostéoclastogenèse en augmentant la production de Rankl dans les cellules stromales de la moelle osseuse, les ostéoblastes et les ostéocytes.37 Le TNF-α active la signalisation cellulaire en se liant à deux types de récepteurs : TNFR I et TNFR II.38 On pense que le TNFR I assure la médiation de la majeure partie de la fonction biologique du TNF-α et est responsable de la synthèse de Rankl dans les cellules de l'ostéo-lignée.39

Dans cette étude, nous avons constaté que l'ablation de Klotho dans les cellules progénitrices Osx + -mensenchymateuses régulait positivement l'expression de TNFR I en même temps que des niveaux endogènes plus élevés d'expression de Tnf-α et d'IL-6 chez les souris mutantes par rapport aux souris témoins. L'analyse GO a en outre confirmé la régulation à la hausse des voies de l'inflammation lors de l'ablation de Klotho. D'autre part, la surexpression de Klotho dans les ostéoblastes a supprimé l'expression du TNFR I aux niveaux de la transcription et des protéines. Plus important encore, par liaison directe de Klotho et TNFR I, Klotho a diminué la translocation nucléaire de NF-κB induite par l'administration de TNF-α et l'induction ultérieure de l'expression de Rankl, indiquant les fonctions anti-inflammatoires de Klotho dans les cellules ostéoblastiques au niveau cellulaire. Cela peut expliquer l'augmentation de l'ostéoclastogenèse observée chez les souris OsxCre;KLfl/fl dans des conditions de parodontite apicale et de lésion traumatique. La fonction de Klotho sous inflammation est cruciale pour les applications cliniques puisque la communauté microbienne complexe dans l'environnement oral peut affecter l'homéostasie et la réparation de l'os alvéolaire.40 OsxCre a été utilisé pour supprimer Klotho dans les cellules progénitrices et donc dans les ostéoblastes et les ostéocytes. L'absence de Klotho dans cette importante population de cellules osseuses a entraîné une incapacité à inhiber le TNFR I, ce qui a accéléré la production de Rankl induite par l'inflammation, conduisant finalement à une résorption osseuse régulée à la hausse. Le TNF-α agit également directement pour augmenter la différenciation des macrophages vers un destin d'ostéoclastes.41 Nous ne pouvons pas exclure la possibilité que la présence de ces cellules in vivo au site inflammatoire contribue également à la réponse de Rankl. Il serait intéressant de déterminer si le progéniteur mésenchymateux-Klotho a un rôle régulateur indirect dans les cellules immunitaires dans de futures études.

La fonction anti-inflammatoire de Klotho a été signalée précédemment dans d'autres endroits, tels que les reins, l'endothélium, le pancréas et le sang périphérique.42,43 Les souris dépourvues de Klotho présentent des dommages inflammatoires accrus chez les animaux atteints de maladies rénales.44 En revanche, une supplémentation exogène de Klotho ou l'expression transgénique de Klotho peut sauver ces processus pathologiques rénaux associés à l'inflammation. cellules, Klotho pourrait être associé au processus inflammatoire en atténuant les molécules d'adhésion et l'expression de NF-κB. Ces observations sont principalement attribuées à la fonction de la forme soluble de Klotho, générée par l'épissage alternatif ou par l'excrétion d'ectodomaine de Klotho lié à la membrane. effet justifie une enquête plus approfondie.

Notre compréhension de base du modèle d'expression cellulaire de Klotho dans les tissus humains reste largement inexplorée. Des études antérieures ont détecté à la fois le Klotho cytoplasmique et lié à la membrane par coloration par immunofluorescence du rein humain, de la glande parathyroïde, du sang périphérique, des monocytes péritonéaux, des cardiomyocytes, des tissus cancéreux du côlon et de plusieurs cellules dérivées de tissus humains.48 Nous montrons ici pour la première fois, la présence de l'expression génique et protéique du Klotho endogène dans le tissu osseux humain. Son expression est limitée à la membrane cellulaire et au cytoplasme dans les ostéoblastes et les ostéocytes, ce qui est conforme à son schéma d'expression général. Des études limitées ont mentionné la fonction nucléaire de Klotho. Allemand et al. trouvé Klotho abondant près de la membrane nucléaire dans les cellules du plexus choroïde et les cellules de Purkinje dans le cerveau.49 Il convient de noter que dans notre étude, nous avons observé que Klotho peut avoir une fonction nucléaire en réponse à des stimuli externes tels que l'inflammation. Plusieurs sources de données appuient ce principe. Premièrement, le modèle d'expression de Klotho a été considérablement modifié chez les patients atteints de parodontite apicale. La protéine Klotho s'est déplacée dans le noyau, accompagnée d'une transcription plus élevée du gène Klotho chez l'homme et la souris en présence de la maladie. La régulation à la hausse de l'expression de Klotho dans l'os alvéolaire dans des conditions pathologiques pourrait avoir un effet protecteur en inhibant la résorption osseuse liée à l'inflammation. Deuxièmement, le test ChIP a confirmé que Klotho était induit par le TNF-α pour une translocalisation nucléaire et lié à l'élément régulateur distal de Rankl. De plus, bien que R-7050 ait bloqué la stimulation de Rankl par TNF-α, une expression de Rankl plus élevée a été détectée dans les ostéoblastes après ablation de Klotho par rapport aux cellules témoins sous traitement par TNF-α et R-7050, soulignant la fonction nucléaire observée de Klotho dans la suppression de Rankl. Ces données ont mis en évidence le rôle potentiel de Klotho au-delà de sa fonction regonisée précédente en tant que protéine liée à la membrane.

En conclusion, nous avons démontré que la suppression spécifique de Klotho chez les progéniteurs Osx+-mensenchymateux diminue la formation osseuse alvéolaire mandibulaire et la résorption osseuse, entraînant une augmentation de la masse osseuse alvéolaire. Nous avons constaté que les ostéoblastes déficients en klotho expriment moins de Rankl, qui est responsable de la suppression de l'ostéoclastogenèse. De plus, la formation osseuse au cours de la réparation osseuse liée à l'inflammation est atténuée dans les ostéoblastes déficients en Klotho. Fait intéressant, Klotho est activé lors du remodelage de l'os alvéolaire chez la souris et l'homme, où il fonctionne pour inhiber l'expression de Rankl induite par le TNF-α dans les cellules de la lignée des ostéoblastes et médie indirectement la formation des ostéoclastes. Ces découvertes révèlent de nouvelles fonctions physiologiques et pathologiques du Klotho exprimé par les progéniteurs mésenchymateux dans la médiation du développement et de la réparation de l'os alvéolaire mandibulaire.

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées avec des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du State Key Laboratory of Oral Diseases de l'Université du Sichuan. Des spécimens chirurgicaux périapicales humains ont été prélevés lorsque tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé pour participer à l'étude et pour l'utilisation de leurs tissus biologiques. L'étude a été examinée et approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital de stomatologie de l'ouest de la Chine, Université du Sichuan.

Des souris Floxées Klotho et OsxCre ont été décrites précédemment.50 Des souris B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J ont été achetées auprès de Jackson Laboratory. Des souris avec un knock-out conditionnel Klotho ont été générées à l'aide du système de recombinaison Cre-LoxP. Des souris KLfl/fl ont été accouplées avec des souris OsxCre pour générer des souris OsxCre;KLfl/+. Ensuite, des souris mâles OsxCre;KLfl/+ ont été croisées avec des femelles KLfl/+ pour obtenir des souris OsxCre (contrôle) et OsxCre;KLfl/fl (mutantes).

Des spécimens osseux de lésions périapicales humaines ont été prélevés au cours de la chirurgie endodontique pour être utilisés comme groupe périapical apical (AP). Des échantillons d'os de contrôle ont été prélevés dans une région normale d'os alvéolaire au cours d'une ostéotomie mandibulaire. Des échantillons ont été prélevés pour l'extraction de l'ARN total et l'examen histologique.

Des souris P0 ont été écorchées et fixées dans de l'éthanol à 95 %. Des colorations au rouge d'alizarine S et au bleu alcian ont été réalisées pour les analyses du cartilage et des tissus minéralisés. Les mandibules et les maxilles de souris âgées de 3 et 11 semaines ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une nuit, puis stockées dans de l'éthanol à 70 % à 4 °C avant le traitement. Les échantillons ont été scannés à l'aide du scanner μCT (μCT50, Scanco, Suisse), fonctionnant à 50 kV, 200 μA, avec un temps d'exposition de 300 ms et une résolution de 7,0 μm par pixel. Les images ont été reconstruites sous forme tridimensionnelle. Les régions d'intérêt ont été sélectionnées parmi la furcation radiculaire de la première molaire mandibulaire dans l'os alvéolaire normal, le niveau 1/3 de l'apex radiculaire dans un modèle de parodontite apicale et l'alvéole radiculaire mésiale de la première molaire maxillaire dans un modèle d'extraction dentaire. Les paramètres liés à l'os ont été mesurés pour analyser la qualité de l'os alvéolaire et la surface de la lésion.

Les échantillons fixés ont été décalcifiés dans 20% d'EDTA (pH 7,5), inclus dans de la paraffine et coupés en sections de 5 μm à l'aide d'un microtome HM360 (Microm). Une coloration à l'hématoxyline (VWR) et à l'éosine (Sigma – Aldrich) a été réalisée pour évaluer l'histomorphologie. La phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP) (Sigma) a été utilisée pour détecter les ostéoclastes selon les protocoles des fabricants. Pour la coloration par immunofluorescence, les lames ont été soumises à un tampon de citrate de sodium à 95 ° C pendant 20 min pour la récupération de l'antigène, perméabilisées avec 0, 5% de Triton X-100 (Beyotime) pendant 10 min et bloquées avec 5% de BSA pendant 1 h. Les lames ont été incubées avec Anti-Runx2 (1:200, Abcam, ab23981), Anti-GFP (1:50, Santa Cruz, sc-9996), Anti-RFP (1:50, Santa Cruz, sc-390909), Anti-Klotho (1:100, R&D, AF1819), Anti-Klotho (1:100, Santa Cruz, sc-515939) ou Anti-Ra nkl (1:100, R&D, AF462) pendant une nuit à 4 °C, et un anticorps secondaire conjugué à la fluorescence, Alexa Fluor 488 ou 568 (Invitrogen, 1:1000) pendant 1 h à température ambiante. Les noyaux ont été contre-colorés avec DAPI (Vector). Les images ont été capturées sur un microscope confocal Olympus FV3000 (Olympus).

Les mandibules des souris témoins et mutantes au jour postnatal 21 (P21) ont été utilisées pour extraire l'ARN total et analyser avec l'ARN-seq. Des bibliothèques de séquençage ont été générées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ARN NEBNext® UltraTM pour Illumina® (NEB, États-Unis) et des codes d'index ont été ajoutés pour corréler les séquences à chaque échantillon. Les préparations de la bibliothèque ont été séquencées sur une plateforme Illumina Hiseq.

Des souris âgées de huit semaines ont été utilisées pour créer des modèles de parodontite apicale et d'extraction dentaire comme décrit précédemment. Les souris ont été anesthésiées par la kétamine (100 mg/kg) et la xylazine (10 mg/kg). Pour le modèle de parodontite apicale, la première molaire mandibulaire droite a été ouverte à l'aide d'une pièce à main à grande vitesse. Les canaux radiculaires ont été sondés avec une lime K endodontique #10 sous un stéréomicroscope (Leica). La chambre pulpaire a été exposée à la cavité buccale pendant 3 semaines. Les premières molaires controlatérales ont été utilisées comme contrôle. Le modèle d'extraction dentaire a été créé en utilisant les premières molaires maxillaires droites, qui ont été extraites avec des aiguilles de seringue 26 G et des forceps sous le stéréomicroscope. Une légère pression a été appliquée pour arrêter le saignement. Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire mou pendant 3 semaines après la chirurgie et sacrifiées.

Les cellules MC3T3 surexprimant Klotho ont été cultivées dans des boîtes de 100 mm et homogénéisées par un test de lyse sur cellules entières (KeyGEN). La concentration de protéines a été mesurée par le kit de dosage de protéines BCA amélioré (Beyotime). L'immunoprécipitation a été réalisée par le réactif d'immunoprécipitation protéine A/G PLUS-agarose (Santa Cruz, sc-2003) conformément aux directives du fabricant. Ensuite, les échantillons ont été dégénérés à 70 ° C avec le tampon d'échantillon NuPAGE LDS et l'agent réducteur NuPAGE (Life Technologies), séparés par NuPAGE 4–12% Bis-Tris SDS / PAGE à l'aide de gels préfabriqués (Invitrogen) et transférés sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (Millipore). Après 1 h de blocage, les membranes ont été incubées avec un anticorps anti-KLOTHO (1:1000, Cosmo Bio, KM2076) ou un anticorps anti-TNFR I (1:1000, Abcam, ab223352) pendant une nuit. Des anticorps secondaires anti-rat/lapin IgG de chèvre conjugués à la HRP (1:5000, anticorps Signalway, L3012 et L35027) ont été utilisés et détectés par un kit de chimiluminescence amélioré (Bio-Rad Laboratories).

Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Pour l'analyse statistique, GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc.) a été utilisé. Les comparaisons à deux groupes ont été évaluées par des tests t de Student bilatéraux non appariés, et des comparaisons multiples ont été effectuées par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) ou une ANOVA bidirectionnelle avec le test post-hoc de Bonferroni. Les valeurs de p <0,05 ont été considérées comme significatives pour toutes les analyses.

Des méthodes étendues et des informations sur le double marquage de la calcéine, les mesures sériques, la culture cellulaire, la transfection, l'immunocytochimie, l'isolement de l'ARN et les analyses qRT-PCR, le test ChIP sont décrites dans Matériels et méthodes supplémentaires.

Les ensembles de données pour l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par les subventions NSFC 81800928, 81901040 et 82171001, le programme de parrainage de jeunes scientifiques d'élite par CAST (n° 2020QNRC001 et 2018QNR001), le programme de science et technologie du Sichuan (n° 2019YJ0054), le financement de la recherche de l'école de Chine occidentale/hôpital de stomatologie de l'université du Sichuan (n° RC DWJS2021-1), State Key Laboratory of Oral Diseases Open Funding Grant SKLOD202114.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yi Fan, Chen Cui.

State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Cariology and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 610041, Chengdu, Sichuan, Chine

Yi Fan, Chen Cui et Ruoshi Xu

Hôpital de stomatologie, École de stomatologie de Guanghua, Université Sun Yat-Sen, Laboratoire clé provincial de stomatologie du Guangdong, 510055, Guangzhou, Guangdong, Chine

Chen Cui et Xi Wei

Institut de recherche du centre médical du Maine, Scarborough, ME, 04074, États-Unis

Clifford J. Rosen

Unité endocrinienne, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, 02215, États-Unis

Tadatoshi Sato

State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthognathic and TMJ Surgery, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 610041, Chengdu, Sichuan, Chine

Peiran Li & Ruiye Bi

State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Oral Implantology, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 610041, Chengdu, Sichuan, Chine

Quan Yuan

State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 610041, Chengdu, Sichuan, Chine

Chenchen Zhou

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CZ, QY et YF ont conçu l'étude et conçu toutes les expériences. YF, CC, CZ, QY et CJR ont rédigé le manuscrit. YF, CC, ST, RX, PL, XW et RB ont réalisé les expériences et analysé les données. Tous les auteurs ont lu et approuvé l'article.

Correspondance à Quan Yuan ou Chenchen Zhou.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Fan, Y., Cui, C., Rosen, CJ et al. Klotho chez les progéniteurs mésenchymateux Osx + exerce des effets pro-ostéogéniques et anti-inflammatoires lors de la formation et de la réparation de l'os alvéolaire mandibulaire. Sig Transduct Target Ther 7, 155 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00957-5

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Reçu : 13 décembre 2021

Révisé : 3 mars 2022

Accepté : 06 mars 2022

Publié: 11 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41392-022-00957-5

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