ERK1/2 est un signal organisateur ancestral en clivage en spirale

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 2286 (2022) Citer cet article

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Le développement animal est classé comme conditionnel ou autonome selon que le destin cellulaire est spécifié par des signaux inductifs ou des déterminants maternels, respectivement. Pourtant, l'évolution de ces deux principaux modes de développement reste incertaine. Au cours du clivage en spirale - une embryogenèse stéréotypée ancestrale de 15 groupes d'invertébrés, y compris des mollusques et des annélides - la plupart des lignées spécifient les destins cellulaires de manière conditionnelle, tandis que certaines définissent les destins axiaux primaires de manière autonome. Pour identifier les mécanismes à l'origine de ce changement, nous étudions Owenia fusiformis, un annélide conditionnel à ramification précoce. À Owenia, la signalisation du récepteur FGF médiée par ERK1/2 spécifie le progéniteur endomésodermique. Cette cellule agit probablement comme un organisateur, induisant des destins mésodermiques et postodorsaux dans les cellules voisines et réprimant les signaux antériorisants. Le rôle organisateur de ERK1/2 chez Owenia est partagé avec les mollusques, mais pas avec les annélides autonomes. Ensemble, ces résultats suggèrent que la spécification conditionnelle d'un organisateur embryonnaire ERK1/2+ est ancestrale dans le clivage en spirale et a été perdue à plusieurs reprises dans les lignées d'annélides à développement autonome.

L'engagement des premières cellules embryonnaires à des destins de développement plus restreints (par exemple, endoderme, neuroectoderme et mésoderme) est une étape cruciale de l'embryogenèse animale qui conduit à l'établissement de plans corporels et influence le développement ultérieur1,2,3. Pour définir cette organisation spatiale précoce, les embryons animaux combinent des interactions cellule-cellule conditionnelles et inductives avec l'héritage asymétrique de déterminants maternels autonomes1,2,4. Fréquemment, l'une de ces stratégies de développement est prédominante et l'embryogenèse animale est donc définie comme conditionnelle ou autonome1,2,4. Au cours de l'évolution, les lignées animales ont effectué une transition entre ces deux principaux modes de spécification du destin cellulaire5. Cependant, la façon dont ces transitions développementales se produisent n'est pas claire car elles coïncident souvent avec une variation supplémentaire de l'embryogenèse précoce (par exemple, dans les schémas de clivage6,7) qui rend les causes des changements de spécification du destin cellulaire difficiles à identifier.

Le clivage en spirale est un programme de développement précoce ancien et stéréotypé caractérisé par des divisions cellulaires obliques alternées à partir du stade 4 cellules que l'on trouve parmi les groupes d'invertébrés de Spiralia, y compris les mollusques et les annélides8,9 (Fig. 1a). Les embryons à clivage en spirale organisent le destin des cellules autour de quatre quadrants embryonnaires - nommés A – D - qui correspondent approximativement aux côtés gauche, ventral, droit et dorsal du corps, respectivement8,9. Bien que le clivage en spirale soit souvent décrit comme un exemple classique de développement autonome2,4, les embryons à clivage en spirale spécifient leurs identités axiales de manière conditionnelle ou autonome, sans que cela n'affecte la conservation globale du programme de clivage et les lignées cellulaires embryonnaires8,9,10 (Fig. 1b). Dans le mode conditionnel de spécification du destin cellulaire, des signaux inductifs entre les cellules du pôle animal et un blastomère végétal au stade ~ 32–64 cellules engagent ce dernier dans le destin D dorsal11. Cette cellule agira comme organisateur embryonnaire, instruisant les cellules voisines vers certains destins et établissant le plan corporel de l'animal (Fig. 1b). Ce mode de clivage en spirale est répandu et très probablement ancestral à Spiralia11,12,13 (mais voir Dohle pour une hypothèse alternative14) (Fig. 1c). Cependant, certaines lignées de mollusques et d'annélides11,12 spécifient les identités axiales par la ségrégation asymétrique des déterminants maternels en un blastomère dans l'embryon au stade 4 cellules15,16,17 (Fig. 1b). Ce blastomère adoptera le destin dorsal D, et l'un de ses descendants agira par la suite comme organisateur embryonnaire. Par conséquent, la présence de modes de développement conditionnels et autonomes chez les animaux à clivage en spirale est un système idéal pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent les transitions de spécification du destin cellulaire dans les embryons animaux. Pourtant, les mécanismes régulant le clivage spiralé, et par extension les basculements en mode développemental, sont mal connus.

a Le clivage en spirale est un mode de développement stéréotypé ancestral de Spiralia (par exemple, les escargots et les vers segmentés), l'une des trois principales lignées d'animaux à symétrie bilatérale (Bilateria). Le clivage en spirale est caractérisé par une alternance de divisions cellulaires obliques (flèches rouges) le long de l'axe végétal animal à partir du stade 4 cellules. b Les embryons à clivage en spirale spécifient leurs identités axiales et leur organisateur embryonnaire de manière conditionnelle ou autonome. En mode conditionnel, la spécification de l'identité postéro-dorsale (quadrant D ; représenté par un D) et de l'organisateur embryonnaire se produit tardivement dans le clivage (~ 32 à 64 stades cellulaires, selon l'espèce) par le biais de signaux inductifs. Le mode autonome de spécification du destin cellulaire, cependant, repose sur des facteurs maternels différentiellement séparés (points rouges) qui spécifient le quadrant D déjà au stade 4 cellules (cellule avec D). Plus tard au cours du clivage, une cellule du quadrant D qui hérite vraisemblablement d'une partie de ces facteurs maternels agira comme organisateur embryonnaire. c Le mode conditionnel se trouve dans toutes les lignées spiraliennes présentant un clivage en spirale et le mode autonome n'est observé que chez les mollusques et les annélides, ce qui suggère que la spécification conditionnelle est ancestrale. Alors que les mollusques conditionnels et autonomes utilisent la MAP kinase ERK1/2 pour établir leur plan corporel, tous les annélides autonomes étudiés ne reposent pas sur cette cascade de signalisation et les connaissances en dehors des mollusques et des annélides sont absentes. Les mécanismes ancestraux contrôlant le clivage spiralé sont donc encore méconnus, ce qui limite notre compréhension de l'évolution de Spiralia. L'annélide conditionnel Owenia fusiformis, en tant que membre de la lignée sœur de tous les annélides restants, peut aider à déduire les caractères de développement ancestraux d'Annelida et de Spiralia dans leur ensemble. Les dessins ne sont pas à l'échelle.

La voie de signalisation ERK1 / 2 - une cascade intracellulaire de kinases conservée au cours de l'évolution - spécifie l'identité du quadrant D dorsal et contrôle l'activité d'organisation chez Mollusca (Fig. 1c; Tableau supplémentaire 1). Dans de nombreux mollusques conditionnels, les interactions inductives activent ERK1/2 dans le blastomère qui adopte le destin D dorsal et agit comme organisateur embryonnaire19,20,21,22,23, bien que l'identité de la lignée de cette cellule varie selon les espèces (tableau supplémentaire 1). De même, ERK1/2 diphosphorylé actif est requis dans le blastomère du quadrant D fonctionnant comme organisateur embryonnaire24 chez le mollusque par ailleurs autonome Tritia obsoleta17. Chez Annelida cependant, les espèces autonomes présentent divers modèles d'activité ERK1 / 2 et n'ont pas besoin de cette voie de signalisation pour spécifier le quadrant D dorsal et l'organisateur embryonnaire (Fig. 1c; Tableau supplémentaire 1). Pourtant, le rôle de ERK1 / 2 lors du clivage en spirale est inconnu pour les annélides conditionnels, ainsi que pour la plupart des autres groupes spiraliens (Fig. 1c). Cela empêche de déduire les mécanismes ancestraux contrôlant la structuration corporelle chez Annelida et Spiralia en général (Fig. 1c), et on ne sait donc pas si le rôle d'organisation axiale de ERK1 / 2 est une innovation mollusque ou un mécanisme ancestral de spécification du destin cellulaire perdu dans certaines lignées d'annélides autonomes.

Dans ce travail, nous avons stratégiquement étudié l'espèce Owenia fusiformis29,30 pour déterminer le rôle de la signalisation ERK1/2 chez un annélide conditionnel (Fig. 1c). Cette espèce marine appartient à Oweniida—le groupe frère de tous les annélides restants31,32—et présente des traits embryonnaires considérés comme ancestraux des annélides30,33. Par conséquent, l'étude d'O. fusiformis peut, par comparaison avec d'autres lignées d'annélides et de spiraliens, aider à déduire des traits ancestraux de ce groupe et de Spiralia en général.

Contrairement aux espèces à mode de développement autonome dans lesquelles le blastomère de la lignée D qui hérite des déterminants maternels est plus grand, les quatre quadrants embryonnaires chez les embryons avec le mode conditionnel de clivage en spirale sont symétriques, ce qui empêche de déduire les identités cellulaires au début du développement. Cependant, la cellule agissant comme organisateur embryonnaire dans le quadrant D diffère la progression du cycle cellulaire par rapport aux blastomères équivalents dans les quadrants A – C et présente un enrichissement en ERK1 / 2 actif (c'est-à-dire diphosphorylé) chez certains mollusques conditionnels10,20 et putativement l'annélide conditionnel Hydroides hexagonus20 (Fig. 1c). Par conséquent, pour déterminer la lignée D et identifier un organisateur embryonnaire potentiel chez O. fusiformis, nous avons d'abord caractérisé la dynamique de division cellulaire et les modèles d'activité de ERK1/2 dans le pôle végétal de la fécondation au début de la gastrulation (6 h après la fécondation, hpf). Dans cet annélide, la première asymétrie de clivage se produit avec l'apparition du quatrième quatuor de micromères (cellules 4q) à ~ 4 hpf, lorsqu'une paire de cellules 4q se forme avant les deux autres (Fig. 1a, b supplémentaires). Pourtant, le pôle végétal reste symétrique et les identités des quadrants embryonnaires sont indiscernables à 5 hpf (stade coeloblastula; Fig. 1c supplémentaire). Cependant, avec le début de la gastrulation à 6 hpf30, tous les blastomères 4q sauf un se divisent (Fig. 1d supplémentaire). La cellule 4q non divisée est plus grande à ce stade et ne se clive en deux grandes cellules qu'après l'ingestion au début de la gastrulation à 7 hpf (Fig. 1e, f supplémentaires). Par conséquent, le premier signe morphologique de symétrie bilatérale chez O. fusiformis se produit avec la formation et la division différée d'un micromère 4q, qui est supposé être la cellule 4d chez d'autres annélides conditionnels avec une dynamique similaire de division et d'entrée des blastomères 4q34,35,36,37.

Pour disséquer les schémas d'activité de ERK1/2 et leur connexion aux micromères 4q chez O. fusiformis, nous avons utilisé un anticorps à réaction croisée contre la forme diphosphorylée active de ERK1/2 (di-P-ERK1/2)20,24 de la fécondation à l'apparition de la symétrie bilatérale et du micromère 4q non divisé (6 hpf). Cet annélide a un seul orthologue ERK1 / 2 exprimé à de faibles niveaux dans les ovocytes actifs et jusqu'à 4 hpf (stade ~ 32 cellules), lorsque son expression et son activité augmentent (Fig. 2a – d supplémentaires). À ce stade, les quatre micromères les plus animaux / apicaux présentent un signal di-P-ERK1 / 2 enrichi (Fig. 2a, b; Fig. 2c supplémentaire), qui disparaît à 5 hpf, lorsque di-P-ERK est enrichi en un micromère 4q à la place (Fig. 2c, d; Fig. 2c supplémentaire). À 6 hpf, le signal di-P-ERK1/2 est enrichi en sept blastomères, dont trois paires de micromères du deuxième quatuor et le micromère 4q qui rompt la symétrie quadri-radiale de l'embryon en reportant le clivage à 7 hpf (Fig. 2e, f ; Fig. 2c supplémentaire). Ensemble, nos données confirment que le di-P-ERK1 / 2 a enrichi le micromère 4q à 5 et 6 hpf chez O. fusiformis et qu'il diffère le clivage jusqu'à 7 hpf est la cellule 4d (Fig. 2g), ressemblant à la condition observée chez l'annélide H. hexagonus20 et de nombreux mollusques gastéropodes19,20,21,22,24.

Projections a–f z-stack d'embryons entiers à 4, 5 et 6 h après la fécondation (hpf) colorées contre l'actif di-phosphorylé-ERK1/2 (di-P-ERK1/2 ; jaune) et les noyaux (DAPI). A 4 hpf (a, b), di-P-ERK1/2 est enrichi en quatre cellules animales (1q111). À 5 hpf (c, d), le signal di-P-ERK1/2 se trouve dans une seule cellule (le micromère 4d ; voir la Fig. 1 supplémentaire), tandis que l'ERK1/2 actif se produit dans six cellules de la lignée 2a-c et la cellule 4d à 6 hpf (e, f). Les encarts de a à f sont des images en fond clair des piles correspondantes. g Représentation schématique du pôle végétal lors de la naissance et de la première division du quatrième quatuor de micromères chez O. fusiformis. En rouge, signal di-P-ERK1/2 enrichi. En d et f, les astérisques pointent vers le pôle animal. Les descriptions pour a–f sont basées sur au moins dix embryons par stade, à partir d'un minimum de deux répétitions biologiques. Les barres d'échelle sont de 50 μm. Les dessins en g ne sont pas à l'échelle.

Pour examiner plus en détail le rôle de la signalisation ERK1 / 2 au cours du développement d'O. fusiformis, nous avons traité des embryons avec de la brefeldine A (BFA), un inhibiteur du trafic intracellulaire des protéines précédemment utilisé pour bloquer l'induction de l'organisateur dans d'autres embryons à clivage en spirale; 29, 38 et U0126, un inhibiteur sélectif de la di-phosphorylation de MEK1 / 2 et ERK1 / 2 24, 39 (Fig. 3a). Pour les deux médicaments, le traitement de la fécondation (~ 0,5 hpf) à 5 hpf, lorsque le di-P-ERK1/2 est enrichi en 4d, bloque efficacement l'activation de ERK1/2 (Fig. 3b ; Fig. Concentration de 10 µM (Fig. 3c ; Fig. 3b supplémentaire ; Tableaux supplémentaires 3 et 4). Par rapport aux échantillons témoins, les embryons traités à 0, 5 à 5 hpf manquent d'une touffe apicale et d'un organe apical complètement formés, montrant une expression ectodermique réduite du marqueur d'organe apical six3/6 et moins de cellules apicales positives pour le marqueur neuronal synaptotagmin-1 (syt1) 30 (Fig. 3d). De plus, les embryons traités manquent d'expression des marqueurs de l'intestin postérieur (cdx) et du tronc mésodermique (torsion)3, présentent une expression élargie du gène marqueur ectodermique oral gsc3 autour de l'ouverture intestinale unique (Fig. 3d; Fig. 3c supplémentaire) et conservent l'expression du marqueur endodermique de l'intestin moyen GATA4 / 5 / 6b3 (Fig. 3c supplémentaire). Nous considérons ce phénotype comme radialisé antéro-ventralement (ou Radial; Tableau supplémentaire 3). Par conséquent, l'activation de la signalisation ERK1/2 dans la cellule 4d au stade coeloblastula est nécessaire pour spécifier et développer des structures postérieures et dorsales au cours de l'embryogenèse d'O. fusiformis, bien que l'inhibition de l'activité ERK1/2 dans le 1q111 (à 4 hpf) puisse également contribuer au phénotype d'organe apical réduit.

a Dessin schématique de la cascade de signalisation ERK1/2 et du mode d'action de Brefeldin A (BFA) et U0126. b Immunocoloration du montage entier contre di-P-ERK1/2 (les panneaux principaux sont des vues latérales ; les encarts sont des vues végétales). Les traitements BFA et U0126 de 0,5 h après la fécondation (hpf) à 5 hpf empêchent l'enrichissement en di-P-ERK1/2 dans la cellule 4d. c Projections latérales de la pile en z du contrôle et des larves BFA/U0126 24 hpf traitées de 0,5 à 5 hpf. Les encarts dans les embryons traités sont des vues ventrales. Les cils sont marqués avec de la tubuline anti-acétylée et de la F-actine avec de la phalloïdine. d Hybridation in situ complète sur des larves témoins et traitées à l'U0126 (0,5–5 hpf). e Représentation schématique des fenêtres de traitement de la toxicomanie analysées. Le nombre de cas est affiché à droite de chaque barre spécifiant l'intervalle de temps. f Distribution et pourcentages des phénotypes larvaires observés pour chaque fenêtre et condition expérimentale (WT, type sauvage ; R, radial). g Caractérisation phénotypique du phénotype larvaire compressé obtenu après traitement BFA de 0,5 hpf à 3–4 hpf. Première rangée, projections latérales de la pile z de larves colorées avec du DAPI (noyaux), de la phalloïdine (F-actine) et de la tubuline acétylée (cils). Rangées du bas, vues latérales de l'hybridation in situ de la monture entière contre des marqueurs ectodermiques apicaux (six3/6), ectodermiques oraux (gsc), intestin postérieur (cdx) et mésodermiques (twist). Les larves comprimées sont normales mais ont un organe apical réduit et leur blastocèle larvaire est en quelque sorte oblitérée. En b–d et g, les astérisques pointent vers le pôle apical. Pour b, le tableau supplémentaire 2 rapporte des chiffres détaillés. Pour c–d et g, les données supplémentaires 1 rapportent des chiffres détaillés. Pour e et f, le tableau supplémentaire 5 rapporte des chiffres détaillés. Les dessins schématiques ne sont pas à l'échelle. ao organe apical, un anus, ch chaetae, mg intestin moyen, mo bouche, pt prototroch. Les barres d'échelle sont de 50 μm.

Pour disséquer le moment exact de l'induction et de l'activité de ERK1/2 pendant le clivage d'O. fusiformis, nous avons traité des embryons avec 10 µM de BFA/U0126 dans des fenêtres temporelles qui se chevauchent, de la fécondation à la gastrulation précoce (Fig. 3e, f ; Tableau supplémentaire 5). Le blocage de la sécrétion de protéines avec BFA de la fécondation au stade 8 cellules n'affecte pas le développement normal. Cependant, le traitement BFA entre le stade 8 cellules et 4 hpf donne des larves avec tous les repères morphologiques d'une larve mitraria typique et une expression normale des marqueurs spécifiques aux tissus, mais avec une morphologie comprimée le long de l'axe apical-ventral, peut-être en raison d'une formation altérée de la blastocèle larvaire (Fig. 3g; Fig. Supplémentaire 3c). Seul le traitement avec BFA de 4 à 6 hpf, et donc couvrant la formation de 4d, provoque un phénotype radial, les traitements après 5 hpf étant mortels (Fig. 3e, f; Fig. Supplémentaire 3c). Tout cela suggère qu'un événement inductif potentiel entraînant l'activation de ERK1 / 2 en 4d devrait se produire entre 4 et 5 hpf, juste pendant la formation du micromère 4q (Fig. 1a – c supplémentaire). De manière inattendue, empêcher la di-phosphorylation de ERK1 / 2 avec U0126 du stade 2 cellules jusqu'à 4 hpf, lorsque cet événement d'induction pourrait commencer, provoque également un phénotype radial (Fig. 3e), avec juste de légères différences entre certains moments (Fig. Supplémentaire 2c). Par conséquent, l'activité ERK1/2 est essentielle pour la structuration embryonnaire normale et le développement postéro-dorsal tout au long du clivage en spirale chez O. fusiformis. Cependant, la combinaison des phénotypes BFA et U0126 suggère que ERK1 / 2 pourrait agir de manière autonome du stade 2 cellules à 4 hpf, alors qu'il nécessite un trafic intracellulaire de protéines - et donc potentiellement des signaux de communication inductifs de cellule à cellule - pour son enrichissement en 4d.

Pour étudier les mécanismes par lesquels ERK1/2 contrôle le développement postodorsal chez O. fusiformis, nous avons ensuite émis l'hypothèse que le profilage à l'échelle du génome de l'expression génique dans les embryons traités avec BFA et U0126 permettrait de découvrir des régulateurs en amont et des cibles en aval de l'activité de ERK1/2. Nous avons donc traité des embryons avec 10 µM de BFA ou 10 µM d'U0126 de la fécondation à 5 hpf (pour couvrir à la fois les phases autonomes et conditionnelles de l'activité ERK1/2) et réalisé un profilage du transcriptome ARN-seq dans les embryons traités et contrôlés collectés juste après l'enrichissement en di-P-ERK1/2 dans la cellule 4d (coeloblastula ; 5,5 hpf) et au stade larvaire (Fig. 4a ; Supplément ary Fig. 4a, b). Les analyses d'expression différentielle ont révélé 90 et 268 gènes exprimés de manière différentielle (DEG; log2 (variation de facteur) <-1, 5 et valeur p ajustée au taux de fausses découvertes <0, 05) dans les coeloblastules et les larves traitées au BFA, respectivement, et 132 (coeloblastula) et 373 (larve) DEG après traitement U0126 (Fig. 4b). Lors de l'examen de toutes les comparaisons et de la suppression des redondances, nous avons détecté un total de 628 DEG, dont 414 (65, 92%) étaient fonctionnellement annotés et enrichis en termes d'ontologie génique liés à la régulation de la transcription, du développement et de la spécification du destin cellulaire (Données supplémentaires 2). La plupart de ces DEG étaient régulés à la baisse (Fig. 4b, c; Fig. 4c, d supplémentaires) et seuls trois DEG (cdx, fer3 et foxH) semblaient systématiquement régulés à la baisse dans les deux médicaments et aux deux moments de développement (Fig. 4b; Fig. 4d supplémentaire). Notamment, les cibles en aval U0126 et BFA ont montré un chevauchement limité (Fig. 4d supplémentaire), probablement en raison de la spécificité différente des deux traitements, le BFA ciblant largement le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines et présentant donc potentiellement plus d'effets hors cible que U0126. Néanmoins, notre approche a révélé un ensemble confiant et relativement petit de gènes dont l'expression dépend fortement de l'activité de ERK1/2.

a Conception expérimentale pour les collections d'ARN-seq. Les barres de couleur unie indiquent la période de contrôle (DMSO), les traitements à la Brefeldine A (BFA) et à l'U0126. Les cercles rouges indiquent la collecte d'échantillons au coeloblastula (5,5 h après la fécondation, hpf) et au stade larvaire (24 hpf). b Nombre de gènes différentiellement exprimés (DE) dans différentes conditions et comparaisons (indiqué par des points blancs et gris en bas ; les points gris mettent en évidence les conditions incluses dans la comparaison), où les barres rouges sont des gènes sous-exprimés et les barres bleues sont des gènes sous-exprimés. c Parcelles volcaniques (test de Wald bilatéral) pour les coeloblastules traités au BFA et à l'U0126. Les points rouges montrent les gènes DE, avec des gènes candidats marqués pour chaque comparaison. d Évolution temporelle et spatiale de l'expression des gènes candidats affectés par une erreur de spécification 4d, qui sont généralement associées au développement apical/antérieur, chaetae/postérieur, de l'intestin postérieur et du mésoderme. La première colonne ("Condition") indique le traitement (BFA ou U0126) et le stade de développement (coeloblastula CB, larve L) auxquels chacun des gènes candidats est exprimé de manière différentielle (chaque condition surlignée d'une couleur différente). La carte thermique centrale montre les valeurs d'expression normalisées du score z pour chaque gène. La ligne pointillée verticale met en évidence le moment de la spécification 4d. La troisième colonne montre des images complètes d'hybridation in situ d'un sous-ensemble de ces 22 gènes candidats aux stades coeloblastula (5 hpf), gastrula (9 hpf) et larvaire (24 hpf). e Seuls trois des gènes candidats (cdx, foxH et fer3) sont régulés à la baisse à tous les stades et comparaisons de traitement. La validation par hybridation in situ démontre que l'expression de ces gènes est perdue après un traitement médicamenteux. En d et e, les images pour cdx au stade coeloblastula et larvaire, condition contrôle, sont les mêmes. En d et e, les astérisques pointent vers le pôle animal/apical, et les pointes de flèches vers les domaines d'expression. Des cartes thermiques in d ont été générées à partir d'un cours temporel de développement généré à partir de deux répliques biologiques, et l'expression in situ a été réalisée avec un minimum de deux répliques biologiques. Pour c et e, les données supplémentaires 1 rapportent des chiffres détaillés. Les barres d'échelle sont de 50 μm. Les dessins schématiques ne sont pas à l'échelle. bp blastopore, mo bouche.

Pour valider que les DEG sont affectés par une erreur de spécification 4d, nous avons sélectionné 22 DEG pour d'autres analyses d'expression génique (Fig. 4d; Tableau supplémentaire 6), y compris une variété de facteurs de transcription qui sont des marqueurs de types de cellules et de tissus particuliers (par exemple, six3/6, gsc, cdx, AP2, foxQ2), nécessaires au développement du mésoderme (par exemple, torsion, main2, foxH) et à la neurogenèse (par exemple, POU4, irxA), ligands Wnt (w nt1, wntA et wnt4), les modulateurs TGF-β (noggin et BAMBI) et les composants de signalisation Notch (delta et notch-like). Les données d'ARN-seq spécifiques au stade couvrant 12 points de développement33, de l'ovocyte non fécondé à la larve mature, ont confirmé que l'expression de tous les gènes candidats régule à la hausse au moment ou juste après la spécification 4d et l'enrichissement en di-P-ERK1/2 dans cette cellule (Fig. 4d). Ces gènes sont exprimés soit dans les domaines apicaux/antérieurs (noggin, BAMBI, foxQ2, POU4, six3/6, gsc), la pointe larvaire postérieure et les poils (fer3, lhx1/5, wnt1, notch, msx2-a, irxA, AP2, wnt4, delta), l'intestin postérieur (cdx) ou des dérivés mésodermiques (foxH, rhox, wntA, POU3 , main2, torsion) (Fig. 4d ; Fig. Supplémentaire 5a–g). L'analyse de l'expression de ces gènes dans les embryons témoins et traités aux stades coeloblastula (5,5 hpf) et larve (24 hpf) a confirmé la disparition des domaines d'expression de ces gènes après traitement avec BFA ou U0126 (Fig. 4e; Fig. Supplémentaire. 5a – g; Données supplémentaires 1; Tableau supplémentaire 7), validant ainsi notre approche RNA-seq. Au total, nos découvertes révèlent un ensemble de gènes co-régulés qui agissent en aval de la signalisation ERK1/2 et qui sont impliqués dans le développement des structures apicales, postéro-dorsales et mésodermiques chez O. fusiformis.

Notre étude RNA-seq et notre criblage de gènes candidats ont révélé neuf gènes exprimés au pôle végétal à 5, 5 hpf et dont l'expression était affectée soit par l'inhibition directe de la di-phosphorylation de ERK1 / 2 (cdx, delta, foxH, wnt1, wntA, rhox, fer3 et AP2) ou altérant le trafic et la sécrétion de protéines intracellulaires (gsc) (Fig. 4e; Fig. 5a, c, e supplémentaires). Aucun de ces gènes n'est exprimé à 5 hpf, au début de l'activité ERK1/2 dans le micromère 4d (Fig. 5a). Au lieu de cela, le marqueur endodermique précoce GATA4/5/6a3, dont l'expression n'est pas affectée par le traitement BFA et U0126, est exprimé symétriquement dans la plaque gastrique (y compris 4d) à ce stade (Fig. 5a ; Fig. 6a supplémentaire). À 5, 5 hpf, une demi-heure après l'activation initiale de la signalisation ERK1 / 2 en 4d, le pôle végétal devient symétrique de manière bilatérale, mais seuls deux des gènes dépendants de ERK1 / 2 (cdx et delta) sont exprimés dans le micromère 4d (Fig. 5b, c). Notamment, ceux-ci sont exprimés dans la cellule 4d d'autres embryons spiraliens (tableau supplémentaire 8), soutenant ainsi notre inférence de lignée cellulaire basée sur la progression du cycle cellulaire, les informations sur la position des cellules et l'activité ERK1/2. Le gène ParaHox cdx, qui est détecté dans l'intestin postérieur d'O. fusiformis au stade larvaire3 (Fig. 4e; Fig. Supplémentaire 6b), s'exprime dans 4d, puis dans les deux cellules filles de 4d (c'est-à-dire les mésentoblastes gauche et droit, ou cellules ML et MR), qui restent indivises et continuent à présenter di-P-ERK1 / 2 actif jusqu'au stade gastrula (Fig. 6a, b; Fig. 1f supplémentaire). De même, le delta Notch-ligand (Fig. 6c, d supplémentaires) est exprimé en 4d à 5,5 hpf, mais aussi chez la plupart des descendants de 1d au pôle animal, ainsi que les micromères animaux et les dérivés ectodermiques du quadrant C et D au pôle végétal (Fig. 5b, c; Fig. 5a supplémentaire). Pour étudier comment ERK1 / 2 pourrait contrôler l'activation de cdx et delta, nous avons utilisé Assay for Transposase-Accessible Chromatin en utilisant des données de séquençage (ATAC-seq) à 5 hpf pour identifier les motifs de facteurs de transcription présents dans les régions de chromatine accessibles associées à ces deux gènes (Fig. 5d). Ceux-ci incluent des motifs de régulateurs transcriptionnels connus pour être modulés par la phosphorylation de ERK1/2, tels que les facteurs ETS, RUNX et GATA18. Par conséquent, la di-phosphorylation de ERK1/2 en 4d semble contrôler l'activité des régulateurs transcriptionnels qui induisent les destins postérieurs (cdx) et les gènes de communication cellule-cellule (delta).

a, b Hybridation in situ complète d'un sous-ensemble de gènes (dépendants et indépendants de ERK1/2) structurant le pôle végétal à 5 ​​et 5,5 h après la fécondation (hpf) respectivement. A 5 hpf (a), lorsque le 4d est précisé (dessin de gauche) seul le marqueur endodermique GATA4/5/6a est exprimé (y compris dans la cellule 4d, pointe de flèche). À 5,5 hpf (b), cdx et delta s'expriment dans la cellule 4d (têtes de flèches) et les micromères des quadrants C et D entourant la cellule 4d commencent à exprimer une gamme de gènes impliqués dans le développement postéro-dorsal et mésodermique (foxH, wnt1, wntA, rhox, fer3 et AP2). Le gène ectodermique oral antérieur gsc, qui n'est pas directement régulé par l'activation de ERK1/2, commence également à s'exprimer à ce moment (têtes de flèches). En b, le brut supérieur correspond aux hybridations in situ colorimétriques et la rangée inférieure correspond aux projections z-stack des hybridations in situ fluorescentes contre-colorées pour les noyaux (avec DAPI) et les bordures cellulaires (avec l'immunohistochimie de la tubuline acétylée). En a et b, tous les panneaux sont des vues végétales. Les descriptions pour a et b sont basées sur au moins dix embryons par stade, à partir d'un minimum de deux répétitions biologiques. c Représentation schématique du pôle végétal et des micromères des quadrants C et D autour du blastomère 4d représentant les domaines d'expression génique (en vert) et les identités cellulaires déduites des gènes étudiés à 5,5 hpf. Les barres d'échelle sont de 50 μm. Les dessins ne sont pas à l'échelle.

projections d'une pile en z (vues végétales) de l'immunohistochimie du montage entier contre ERK1/2 di-phosphorylé (di-P-ERK1/2) de 7 à 9 h après la fécondation (hpf). Le micromère 4d se clive à 7 hpf dans les cellules filles MR et ML (Fig. 1 supplémentaire). b Projection z-stack (vue végétale) d'une hybridation in situ fluorescente entière contre cdx (jaune) au stade gastrula (9 hpf), contre-colorée avec DAPI (noyaux) et tubuline acétylée (limites cellulaires). c Distribution des motifs de facteurs de transcription accessibles dans les régions de chromatine ouvertes autour des loci cdx (partie supérieure) et delta (partie inférieure) à 5 hpf. Le bleu foncé et le bleu clair représentent les deux répliques ATAC-seq. d Projections z-stack (vues végétales) d'hybridations fluorescentes in situ contre foxH de 6 à 9 hpf (c'est-à-dire gastrulation), contre-colorées avec DAPI (noyaux), tubuline acétylée (limites cellulaires) et phospho-Histone3 (rouge ; marqueur de la mitose). e Dessins schématiques des cellules entourant 4d et MR/ML pendant la gastrulation, illustrant l'expression de foxH basée sur d. f Nombre de contacts cellulaires pour chacun des micromères 4q à 5,5 hpf basé sur l'analyse de huit embryons colorés pour l'actine membranaire. La cellule 4d établit plus de contacts cellulaires que tout autre micromère 4q au début de la gastrulation. g Projections z-stack (vues végétales) d'hybridations fluorescentes in situ contre gsc et AP2 à 5,5 hpf, contre-colorées avec DAPI (noyaux) et tubuline acétylée (limites cellulaires). Une erreur de spécification 4d étend le gène ectodermique oral gsc et altère l'expression du gène postérieur AP2, car tous les micromères 4q (astérisques) se comportent de la même manière. l'expression de la gsc est perdue dans les embryons traités à la brèveeldine A (BFA), ce qui suggère qu'elle pourrait nécessiter des signaux inductifs. En d et g, les flèches et pointes de flèche pointent vers les domaines d'expression. Les descriptions pour a, b et d sont basées sur au moins dix embryons par stade, à partir d'un minimum de deux répétitions biologiques. Pour g, le tableau supplémentaire 9 rapporte des chiffres détaillés. Les barres d'échelle sont de 50 μm. Les dessins schématiques ne sont pas à l'échelle. ar archenteron, bl blastopore.

Les six autres gènes supplémentaires dépendants de ERK1 / 2 modèlent les micromères entourant 4d à 5, 5 hpf, définissant les domaines mésodermique et ectodermique postérieur (Fig. 5b, c). Le facteur de transcription foxH (Fig. 6e supplémentaire), qui régule le développement du mésoderme pendant la gastrulation chez les embryons de vertébrés40,41,42,43, est détecté dans quatre micromères adjacents à 4d (Fig. 5b, c), ce qui pourrait contribuer à l'ectomesoderme latéral selon des études de traçage de la lignée chez l'annélide Urechis caupo37. Au cours de la gastrulation, ces cellules foxH + subissent une division cellulaire asymétrique au niveau de plans de clivage orthogonaux pour finir par entourer les cellules MR et ML (Fig. 6d, e). Plus tard au cours de l'allongement axial, l'expression de foxH forme un motif postérieur en forme de V de précurseurs mésodermiques putatifs, s'estompant au stade larvaire (Fig. 6b supplémentaire). Les ligands wnt1 et wntA (Fig. 6f supplémentaire), exprimés dans la région postérieure et le quadrant D au cours du développement chez l'annélide Platynereis dumerilii44, sont exprimés dans deux colonnes symétriques bilatérales de micromères et wntA est également détecté dans deux micromères supplémentaires du quadrant D (Fig. 5b, c). L'homeobox rhox (Fig. 6g supplémentaire), qui est exprimé dans les cellules germinales primordiales mâles et femelles chez les vertébrés45, est détecté dans deux micromères végétaux du quadrant D (Fig. 5b, c) puis dans deux petites cellules à l'intérieur du blastocèle dans la gastrula (Fig. 5e supplémentaire). Les facteurs de transcription fer3 et AP2 sont exprimés respectivement dans deux micromères uniques et dans un domaine ectodermique postérieur plus large, se limitant à un petit domaine d'expression au niveau ou à proximité du sac chaetal postérieur de la larve (Fig. 5b, c; Fig. 5c et 6b supplémentaires). Notamment, la cellule 4d, qui a une taille de cellule plus grande que les autres micromères 4q car elle ne se divise pas à 5, 5 et 6 hpf (Fig. 1 supplémentaire), établit presque un double contact direct cellule-cellule avec ses cellules environnantes - y compris la plupart des cellules exprimant foxH, wnt1, wntA, rhox et AP2 - que chacune des cellules filles de 4a – c (Fig. 6e). Par conséquent, ces résultats soutiennent un rôle inducteur probable du 4d dans la définition des destins mésodermiques et postérodorsaux, bien que des études d'ablation cellulaire et/ou de transplantation cellulaire soient nécessaires pour valider expérimentalement cette hypothèse.

Le gène homeobox gsc est le seul candidat exprimé en dehors du quadrant D à 5, 5 hpf, étant détecté dans un domaine en forme de U de micromères des quadrants A, B et C qui occupent le rebord blastoporal antérolatéral prospectif (Fig. 5b, c). L'expression de gsc est indépendante de l'activité de ERK1/2, conformément à sa localisation en dehors du quadrant D, mais est régulée à la baisse après le traitement par BFA (Données supplémentaires 1). En conséquence, l'expression de la gsc disparaît dans les coeloblastules traitées au BFA, tandis que l'inhibition de l'activité de ERK1/2 avec U0126 étend les domaines de la gsc, qui sont détectés dans tous les quadrants embryonnaires de manière radiale (Fig. 6f ; Tableau supplémentaire 9). En effet, dans les embryons inhibés par ERK1 / 2, tous les micromères 4q se clivent en 4q1 et 4q2, car aucun 4q ne devient la cellule 4d (Fig. 6f). Par conséquent, tous les quadrants adoptent des destins antéroventraux (gsc), empêchant l'expression de gènes marqueurs postérieurs tels que AP2 (Fig. 6f; Tableau supplémentaire 9). Ces résultats démontrent que le phénotype radial observé après U0126 est une conséquence d'une mauvaise spécification de la cellule 4d, et non le résultat de la spécification du quadrant D mais ne se développant pas davantage. De plus, ces données démontrent également que la spécification de la cellule 4d par l'activité de ERK1/2 réprime les destins antérieurs, comme le montre la limitation de l'expression de gsc.

La régulation à la hausse du delta Notch-ligand en 4d après l'activation de ERK1 / 2 suggère que le rôle de 4d dans la promotion du développement postodorsal pourrait se produire par une communication directe cellule-cellule médiée par la voie de signalisation Notch. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité des embryons avant et après la spécification de 4d avec la petite molécule LY411575, qui est un inhibiteur sélectif de la gamma-sécrétase qui clive le domaine intracellulaire Notch actif lors de l'activation de Notch par Delta46 (Fig. 7a, b). Les larves issues d'embryons traités avec LY411575 de la fécondation à 5 hpf présentent un phénotype normal, avec une symétrie bilatérale évidente et une organogenèse normale (Fig. 7b – e; Tableau supplémentaire 10). Cependant, l'inhibition de la voie Notch à partir de 5 hpf, lorsque l'activité ERK1 / 2 spécifie la cellule 4d, se traduit par des larves à symétrie bilatérale, un intestin traversant avec une bouche entièrement antériorisée, un organe apical, mais des tissus postéro-dorsaux plus courts, un phénotype que nous appelons «tronqué» (Fig. 7b, c, f; Tableau supplémentaire 10). En conséquence, ces larves expriment gsc dans l'ectoderme oral antérieur et ont un intestin postérieur court exprimant cdx (Fig. 7g; Tableau supplémentaire 11). Le phénotype «tronqué» diffère donc du phénotype radial observé lors de l'inhibition de ERK1 / 2 en ce que les identités axiales sont spécifiées dans le premier, mais uniquement les destins antéroventraux dans le second (tableau supplémentaire 3). Notamment, l'ectoderme postodorsal de la gastrula exprime un ligand en forme d'encoche et, comme observé pour delta, son expression est régulée par l'activité ERK1 / 2 (Fig. 4d; Fig. Supplémentaire 5f). Ensemble, nos résultats confirment que l'activation de ERK1/2 dans la cellule 4d facilite la signalisation Notch dans celle-ci et les cellules postéro-dorsales environnantes, ce qui est tout à fait nécessaire au développement normal des structures postérieures et dorsales. Cependant, d'autres études permettront d'élucider le réseau de régulation génique exact reliant la signalisation ERK1/2 et Notch pour contrôler le développement axial chez O. fusiformis.

a Dessin schématique de la voie de signalisation Notch-Delta, le ligand Delta étant exprimé dans la cellule 4d (voir Fig. 5b) et un récepteur Notch dans ses cellules voisines (Fig. 4d). b Représentation schématique des deux fenêtres de traitement médicamenteux menées dans cette étude (le nombre de cas est indiqué à droite de chaque barre spécifiant l'intervalle de temps). Pour évaluer le rôle de la voie de signalisation Notch après la régulation positive de delta en 4 jours, nous avons traité des embryons avant et après sa spécification. c Distribution et pourcentages des phénotypes larvaires observés pour chaque fenêtre et condition expérimentale (WT, type sauvage). d Projections z-stack des embryons témoins et traités au LY411575 (de 0 à 5 hpf) colorés au DAPI (noyaux) et à la tubuline acétylée (AcTub; cils). Les embryons témoins et traités présentent une morphologie normale. e Vues latérales de l'ensemble de l'hybridation in situ de marqueurs pour les types de cellules neurales apicales (syt1; synaptotagmine-1), l'ectoderme oral (gsc) et les tissus dérivés de 4d et l'intestin postérieur (cdx) dans une condition de traitement comme dans d. Le contrôle et les larves des embryons traités présentent des schémas d'expression génique normaux. Les encarts sont des vues ventrales et les flèches pointent vers les domaines d'expression. f Projections z-stack des embryons témoins et traités au LY411575 (de 5 à 25 hpf) colorés au DAPI (noyaux) et à la tubuline acétylée (AcTub; cils). Les larves des embryons traités présentent une symétrie bilatérale et un organe apical normal, mais ont un côté postéro-dorsal réduit, avec un intestin postérieur plus court/anormal et une région chaétale sous-développée. Nous avons appelé ce phénotype "stubby". e Vues latérales de l'ensemble de l'hybridation in situ de marqueurs pour les types de cellules neurales apicales (syt1 ; synaptotagmine-1), l'ectoderme oral (gsc) et les tissus dérivés de 4d et l'intestin postérieur (cdx) dans une condition de traitement comme dans f. Les encarts sont des vues ventrales et les flèches pointent vers les domaines d'expression. En d–g, les astérisques marquent le pôle antérieur/apical. Les descriptions pour b sont basées sur au moins dix embryons par stade, à partir d'un minimum de deux répétitions biologiques. Pour b–g, le tableau supplémentaire 11 rapporte des chiffres détaillés. Les barres d'échelle sont de 50 μm. ch chaetae, hg intestin postérieur, mg intestin moyen, mo bouche, pt prototroch.

Dans les embryons de vertébrés, la signalisation FGF médiée par l'activité ERK1/2 régule l'expression de cdx et delta dans l'intestin postérieur en développement et le mésoderme présomitique pendant l'élongation postérieure du tronc47. Nous avons donc émis l'hypothèse que la signalisation FGF pourrait être le régulateur en amont de l'activité ERK1 / 2 en 4d chez O. fusiformis (Fig. 8a), qui est également nécessaire pour induire l'expression de cdx et delta et spécifier le progéniteur mésodermique de l'intestin postérieur et du tronc. Owenia fusiformis possède un seul récepteur FGF (FGFR; Fig. 7a supplémentaire) avec une conservation élevée des acides aminés au niveau des résidus fonctionnels clés par rapport à l'orthologue FGFR1 humain (Fig. 7b supplémentaire). Alors qu'il est régulé à la hausse par la transcription au stade de la gastrula et semble être exprimé principalement dans les dérivés mésodermiques à partir de la gastrula (Fig. 7c, d supplémentaires), le FGFR semble faiblement exprimé dans la plaque gastrique au stade coeloblastula chez O. fusiformis (Fig. 8b), comme également observé chez les brachiopodes et les phoronides48. À ce stade, les ligands du FGF ne sont que faiblement exprimés (Fig. 7c supplémentaire) et ne sont pas détectés par hybridation in situ. Le traitement avec 30 µM de SU5402, un inhibiteur sélectif de la phosphorylation et de l'activation du FGFR49 (Fig. 8a), empêche l'enrichissement en di-P-ERK1/2 à la cellule 4d dans 96 % des embryons traités à 5 hpf (Fig. 8c ; Fig. 7e supplémentaire). En effet, le traitement avec SU5402 lors de la spécification du micromère 4d (4–6 hpf et 3–7 hpf; Fig. 6c; Tableau supplémentaire 12) entraîne un phénotype radialisé vers l'avant, avec des embryons se développant en larves dépourvues d'expression postérieure (intestin postérieur et cdx) et mésodermiques réduites (muscles et expression de torsion) et montrant des destins ectodermiques oraux (gsc) (Fig. 8g ; tableau supplémentaire 3). Par conséquent, d'un point de vue morphologique et marqueur génique, ce phénotype radial est similaire à celui obtenu après inhibition de la di-phosphorylation de ERK1/2 avec U0126 et BFA. À l'inverse, le traitement avant l'enrichissement en di-P-ERK1 / 2 en 4 jours (3–5 hpf) provoque un phénotype légèrement compressé (Fig. 6f supplémentaire), également similaire à celui observé lors du blocage du trafic de protéines intracellulaires avec BFA à des moments équivalents. Par conséquent, l'inhibition du FGFR bloque l'activation de ERK1 / 2 et phénocopie l'effet de U0126 et de BFA (Fig. 3c), suggérant que l'activité de signalisation du FGF est en amont et nécessaire pour la spécification 4d chez O. fusiformis.

a Dessin schématique de la voie intracellulaire du FGFR en aval. Le médicament SU5402 inhibe spécifiquement les récepteurs tyrosine kinase de type FGF/VEGF, qui peuvent signaler via la cascade de signalisation ERK1/2. b Hybridation in situ complète pour FGFR et VEGFR au stade coeloblastula chez O. fusiformis. Le FGFR est exprimé faiblement au niveau de la plaque gastrique au moment du re-pattering postérieur 4d-instruit. Cependant, le VEGFR, que le traitement au SU5402 peut également inhiber, n'est pas exprimé à ce stade. c Immunohistochimie de montage entier contre ERK1/2 di-phosphorylé (di-P-ERK1/2). Les embryons traités au SU5402 perdent leur enrichissement en ERK1/2 dans un micromère végétal 5 h après la fécondation (hpf). Les images principales sont des vues latérales et les encarts sont des vues végétales. d Représentation schématique des fenêtres de traitement médicamenteux menées dans cette étude, ciblant la période de spécification 4d (5 hpf). Le nombre de cas est affiché à droite de chaque barre spécifiant l'intervalle de temps. e Distribution et pourcentages des phénotypes larvaires observés pour chaque fenêtre et condition expérimentale (WT, type sauvage). f Vues latérales des projections z-stack du contrôle et 4–6 hpf SU5402 embryons traités fixés au stade larvaire et colorés avec du DAPI (noyaux), de la phalloïdine (F-actine) et de la tubuline acétylée (cils). Les larves traitées présentent une phénocopie du phénotype larvaire radial U0126. A gauche, schémas de vues latérales des témoins et phénotypes larvaires radiaux. g Vues latérales de l'hybridation in situ du montage entier de cinq marqueurs de type cellulaire dans le contrôle et 4 à 6 embryons traités au SU5402 hpf fixés au stade larvaire. Les embryons traités se développent en larves radialisées avec des marqueurs ectodermiques oraux étendus (gsc), des marqueurs ectodermiques apicaux réduits (six3/6), un manque de gènes mésodermiques de l'intestin postérieur et du tronc (cdx et twist, respectivement) et des marqueurs normaux de l'intestin moyen (GATA4/5/6b). Les encarts sont des vues ventrales. En b, c, f et g, les astérisques pointent vers le pôle apical. Pour d–g, le tableau supplémentaire 12 rapporte des chiffres détaillés. Les barres d'échelle sont de 50 μm. Les dessins schématiques ne sont pas à l'échelle. an anus, ao organe apical, ch chaetae, gp gastral plate, mg midgut, mo bouche, pt prototroch.

Combinant la caractérisation fonctionnelle des voies de signalisation FGFR, ERK1/2 et Notch avec la transcriptomique comparative chez O. fusiformis, un annélide au mode de développement conditionnel, notre étude résout des questions de longue date8 sur les principes génétiques ancestraux contrôlant la structuration précoce du corps lors du clivage en spirale. Différent de ce qui est observé chez les annélides autonomes25,26,27,28, notre étude fournit des preuves convaincantes que la signalisation FGFR et ERK1/2 induisent une structuration axiale en spécifiant le micromère 4d - l'organisateur embryonnaire putatif - et en activant les gènes en aval impliqués dans le mésoderme et le développement postérodorsal chez O. fusiformis (Fig. 9a). Comme observé chez certains mollusques, l'activité FGFR / ERK1 / 2 rompt la symétrie quadri-radiale de l'embryon en retardant la progression du cycle cellulaire dans la cellule 4d (Fig. 2e; Fig. 6f; Fig. Parallèlement à la spécification des identités 4d et postérodorsales, les destins antérieurs se limitent aux quadrants A – C (Fig. 6f), ce qui suggère que des signaux opposés inconnus - l'un spécifiant les destins antérieurs et un autre conduisant à la spécification 4d via FGFR / ERK1 / 2 - pourraient agir simultanément pour définir la polarité axiale chez O. fusiformis (Fig. 9a). Bien que des travaux supplémentaires soient nécessaires pour identifier ces signaux, nous émettons l'hypothèse que le signal antériorisant doit provenir soit de lignées cellulaires déjà spécifiées à ces stades (par exemple, l'intestin moyen et l'organe apical), soit de déterminants maternels autonomes cellulaires qui sont sélectivement éliminés du quadrant D lors de la spécification 4d. De plus, l'activité FGFR / ERK1 / 2 régule à la hausse le Notch-ligand delta dans la cellule 4d et un récepteur de type notch dans l'ectoderme postodorsal de la gastrula (Fig. 4d; Fig. 5b), et donc la signalisation Notch-Delta - une voie largement utilisée pour affiner le destin cellulaire par inhibition / induction directe de cellule à cellule - est l'un des effecteurs en aval requis pour le postodorsal et le mésoderme al développement dans O. fusiformis (Fig. 7f, g ; Fig. 9a). Dans l'ensemble, nos découvertes décrivent un modèle complet du développement précoce d'un annélide avec un clivage en spirale conditionnel, jetant les bases d'études supplémentaires qui disséquent la logique de régulation exacte qui sous-tend la structuration du corps dans ce clade animal et Spiralia en général.

un modèle schématique de l'activité FGFR / ERK1 / 2 dans le micromère 4d lors du clivage en spirale tardif chez O. fusiformis. À 4 h après la fécondation (hpf), ERK1/2 diphosphorylé (di-P-ERK1/2) est enrichi dans la plupart des micromères apicaux (1q111). A 5 hpf, un signal non identifié active le récepteur FGF qui di-phosphoryle ERK1/2 dans le micromère 4d. Cela active cdx et delta en 4d (devenant le précurseur endomésodermique), ce qui est également en corrélation avec 4d arrêtant la progression de son cycle cellulaire, lors du clivage de 4a à 4c. L'activation de ERK1 / 2 en 4d est nécessaire pour limiter les gènes antérieurs (par exemple, gsc) aux quadrants A – C, mais la nature exacte de cette interaction n'est pas claire (lignes pointillées). De plus, l'activité ERK1/2 en 4d induit l'expression d'une batterie de gènes dans le quadrant D et une partie du quadrant C qui induit probablement des destins mésodermiques et postérodorsaux latéraux, contrôlant finalement l'élongation axiale. À partir de ce stade, la voie Notch-Delta est nécessaire au développement postodorsal normal et pourrait contribuer à transmettre l'activité inductive de la cellule 4d aux cellules voisines (ligne pointillée). b Dessins schématiques d'embryons au moment de l'élongation axiale antéropostérieure dans différentes lignées bilatérales, avec les interactions entre FGFR, ERK1/2 et certains des gènes candidats identifiés dans cette étude dans chaque lignée représentée à gauche. L'implication similaire de l'activation de ERK1/2 dans la spécification de l'organisateur embryonnaire du quadrant D chez O. fusiformis et d'autres embryons de mollusques suggère que la présence d'un organisateur embryonnaire positif pour ERK1/2 est un trait ancestral partagé du clivage en spirale. Plus largement, l'activité ERK1/2 induit l'expression d'un ensemble de gènes et de voies de signalisation qui sont impliqués à plusieurs reprises dans la structuration axiale et la croissance du tronc postérieur chez les embryons bilatéraux. Alors que l'organisation axiale et la formation d'un centre d'allongement postérieur sont le plus souvent spatialement et temporellement découplées dans la plupart des lignées bilatérales, elles s'intègrent dans un processus de développement unique de l'activité d'organisation embryonnaire (c'est-à-dire la spécification de l'organisateur embryonnaire du quadrant D) chez les spiraliens. Les dessins ne sont pas à l'échelle. A antérieur, P postérieur, D dorsal, V ventral.

L'activation de FGFR/ERK1/2 dans le blastomère 4d pour contrôler les identités axiales et la structuration du corps chez O. fusiformis est cohérente avec l'activité de ERK1/2 dans la cellule 4d de l'annélide conditionnel H. hexagonus20. Il reflète également la condition observée chez les mollusques, qui malgré des modèles quelque peu divers d'activité précoce de ERK1/210,21 (tableau supplémentaire 1), utilisent généralement ERK1/2 di-phosphorylé actif pour spécifier et réguler l'organisateur embryonnaire postodorsal dans le blastomère 3D ou sa cellule fille 4d. En effet, la contribution de 4d à l'intestin postérieur chez O. fusiformis est également observée chez les mollusques51,52, mais pas chez certains annélides autonomes53, et la signalisation Notch pourrait également sous-tendre le rôle potentiel d'instruction de la cellule 4d chez le mollusque Tritia obsoleta54 (Fig. 9a). Pourtant, la spécification du quadrant D et de l'organisateur embryonnaire repose sur des contacts directs cellule-cellule - et des signaux inductifs actuellement inconnus - entre les micromères animaux et la cellule 3D prospective chez les mollusques55, ce qui est peu susceptible de se produire chez O. fusiformis30 et d'autres annélides conditionnels29 avec de grands blastocèles au moment de la formation des micromères 4q. Par conséquent, les régulateurs en amont de l'activité ERK1/2 dans les cellules 3D/4d pourraient différer entre les mollusques et les annélides, et il est donc possible que les similitudes dans les voies intracellulaires et les lectures lors de la spécification axiale observées entre ces deux groupes soient le résultat d'une évolution convergente. Cependant, un scénario alternatif, plus parcimonieux, est que le rôle d'activation et de structuration axiale de ERK1 / 2 dans la cellule qui agit comme organisateur embryonnaire est homologue à Annelida et Mollusca (Fig. 9b) et donc un trait fondamental du clivage en spirale. Le tableau des modèles ERK1/2 observés chez les annélides autonomes26,27,28 (tableau supplémentaire 1) représenterait ainsi des pertes indépendantes d'un organisateur ERK1/2+ ancestral lié peut-être à une transition vers un mode autonome de spécification du destin cellulaire. À l'avenir, une meilleure compréhension des réseaux de régulation des gènes en amont contrôlant l'activité de ERK1/2 chez les annélides et les mollusques permettra de tester ce scénario et de disséquer les mécanismes favorisant la variabilité de l'identité cellulaire de l'organisateur embryonnaire à travers Spiralia.

Plus généralement, notre étude révèle des similitudes frappantes entre la cascade moléculaire spécifiant l'organisateur embryonnaire et les identités postodorsales chez les spiraliens conditionnels et les modules de gènes régulant la structuration axiale et la croissance postérieure chez Deuterostomia et Ecdysozoa47,48,56,57,58 (Fig. 9b; Tableau supplémentaire 13). Bien que les logiques de régulation exactes varient selon les principales lignées - et parfois même entre les clades phylogénétiquement liés - l'activité ERK1 / 2 est au cœur de la structuration dorso-ventrale chez les échinodermes, les hémichordés et les accords, et avec le FGFR contribue à la croissance postérieure des accords, favorisant l'expression de cdx et delta à l'extrémité postérieure de la queue en croissance (Fig. 9b; Tableau supplémentaire 14 et références). De même, la signalisation FGFR entraîne la structuration dorso-ventrale chez un arthropode, l'araignée Parasteatoda tepidariorum (tableau supplémentaire 14). La voie de signalisation Notch-Delta est également impliquée dans l'élongation postérieure chez les hémichordés, les accords, les arthropodes et contrôle les identités postérieure et dorsoventrale chez les nématodes (Fig. 9b; Tableau supplémentaire 14 et références). Par conséquent, des principes génétiques et de développement anciens et largement conservés sous-tendent le mode conditionnel de spécification du destin cellulaire dans le clivage en spirale, renforçant encore l'idée que ce mode de développement représente la condition ancestrale de Spiralia11,12,13. Contrairement à d'autres embryogenèses précoces, cependant, le clivage en spirale, avec son modèle stéréotypé très unique de divisions cellulaires et de développement précoce avec un nombre réduit de blastomères, combine l'instruction des identités axiales et du développement postérieur temporellement et spatialement ensemble dans une seule cellule organisatrice - la 3D/4d chez les mollusques et très probablement la cellule 4d chez les annélides (Fig. 9b). Comment cette cellule, et son rôle de modèle d'instruction conservé, favorise le développement ultérieur de morphologies adultes profondément différentes chez Spiralia reste une question ouverte, qu'une enquête détaillée des modules génétiques en aval de l'organisateur du quadrant D à travers les lignées spiraliennes aidera à résoudre.

Des spécimens adultes d'O. fusiformis Delle Chiaje, 1844 ont été collectés sur la côte près de la Station Biologique de Roscoff (France) pendant la saison de reproduction (mai-juillet). Au laboratoire, les animaux ont été maintenus dans de l'eau de mer artificielle (ASW) à 15 °C. Les fécondations in vitro ont été menées comme décrit précédemment3,30 et les embryons se développent dans des bols en verre avec ASW filtré à 19 ° C jusqu'au stade embryonnaire souhaité.

Les embryons ont été traités soit avec la brefeldine A (BFA; Sigma-Aldrich, #B7651), U0126 (Sigma-Aldrich, #U120), LY411575 (Sigma-Aldrich, #SML0506) ou SU5402 (Sigma-Aldrich, #572630). Tous les stocks de médicaments ont été préparés dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et dilués dans ASW avant utilisation, avec des concentrations de travail optimales (10 µM pour BFA et U0126, 100 µM pour LY411575 et 30 µM pour SU5402) établies après le titrage initial. Pour tous les traitements médicamenteux, des volumes équivalents de DMSO ont été utilisés comme contrôle négatif et, dans tous les cas, les traitements ont été initiés à environ 0,5 h après la fécondation (hpf), juste après la fécondation et le prélèvement de sperme, ou comme indiqué sur chaque figure. Les traitements ont été arrêtés en éliminant le médicament avec au moins trois lavages dans ASW et les embryons ont été soit collectés pour des analyses en aval, soit élevés jusqu'au stade larvaire. Les échantillons prélevés pour l'immunohistochimie et les analyses d'expression génique ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans de l'ASW pendant 1 h à température ambiante (RT). Les larves ont été relaxées dans du chlorure de magnésium à 8 % (MgCl2) avant la fixation et fixées dans du PFA à 4 % dans du MgCl2 à 8 % pendant 1 h à température ambiante. Après fixation, les échantillons ont été lavés plusieurs fois avec une solution saline tamponnée au phosphate de Tween-20 (PTw) à 0, 1% et soit stockés dans du PTw à 4 ° C pour l'immunohistochimie, soit déshydratés à 100% de méthanol et stockés à -20 ° C pour le montage complet hybridation in situ. Les embryons et les larves traités et témoins collectés pour les analyses d'ARN-seq ont été congelés instantanément dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C avant l'extraction de l'ARN total.

Le marquage de la F-actine et la coloration des anticorps ont été effectués comme décrit précédemment, avec la modification que les échantillons collectés pour la coloration anti-di-P-ERK1/2 ont été lavés dans du PTw additionné d'une dilution de 1:100 d'inhibiteurs de la phosphatase (Cell Signalling, # 5872) après fixation. Les anticorps primaires de souris anti-double phosphorylé ERK1/2 (Sigma-Aldrich, #M8159, 1:200) et de souris anti-α-tubuline acétylée (clone 6-11B-1, Millipore-446 Sigma, #MABT868, 1:500) ont été dilués dans 5% de sérum de chèvre normal (NGS) dans 0,1% de Triton X-100 tampon phosphate salin ( PTx) et incubé une nuit (ON) à 4 °C. Après plusieurs lavages dans de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 1 % dans du PTx, les échantillons ont été incubés avec soit un anticorps conjugué à la peroxydase de souris (POD) (Millipore-Sigma, #11207733910, 1:100) ou un anticorps conjugué AlexaFluor594 (ThermoFisher Scientific, #A32731, 1:600) dilué dans 5 % de N GS dans PTx ON à 4 °C. Pour les échantillons incubés avec un anticorps conjugué anti-double phosphorylé ERK1/2 de souris et anti-POD de souris, le signal a été développé en utilisant soit de la diaminobenzidine (DAB) (Vector Laboratories, # SK-4100) soit un kit d'amplification du signal Tyramide (Akoya Biosciences, # NEL742001KT) conformément aux recommandations du fabricant. Les échantillons développés par DAB ont été stockés dans 70% de glycérol et contre-colorés avec le marqueur nucléaire 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, ThermoFisher Scientific, # D3571, 1: 1000). Les échantillons pour la microscopie confocale à balayage laser (LSCM) ont été contre-colorés avec du DAPI dilué dans 1 % d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PTx pendant 1 h à température ambiante et montés dans du glycérol à 70 %.

L'ARN total a été extrait à l'aide du kit Monarch total RNA Miniprep (New England Biolabs, #T2010) et utilisé pour la préparation de la bibliothèque d'ARNm brin Illumina. Le séquençage a été effectué sur une plate-forme Illumina HiSeq 4000 en mode de sortie appariée à 75 bases, générant environ 20 millions de lectures par échantillon. Les séquences d'adaptateurs et les bases de mauvaise qualité ont été supprimées à l'aide de Trimmomatic v.0.3659. Les lectures nettoyées ont ensuite été cartographiées sur l'annotation du génome de référence d'O. fusiformis33 (disponible dans le référentiel European Nucleotide Archive sous le numéro d'accession GCA_903813345) à l'aide de Kallisto v.0.44.0 pour générer le nombre d'expressions géniques60. Des analyses différentielles de l'expression génique ont été effectuées indépendamment pour chaque médicament et calculées dans des comparaisons par paires de différentes étapes et conditions à l'aide du package R DEseq2 v.1.38.061. Le seuil de signification a été ajusté à une valeur p ≤ 0, 05 et à un changement de facteur Log2> 1, 5 ou <−1, 5 (données supplémentaires 1). Les PCA et le regroupement hiérarchique ont été tracés à l'aide des packages ggplot2 et pheatmap R, respectivement. Des parcelles de volcan ont été obtenues avec le package EnhancedVolcano, disponible dans R. Les gènes candidats pour d'autres analyses d'expression génique ont été sélectionnés en fonction de leur expression différentielle dans les deux traitements médicamenteux (U0126 et BFA) ou de leur expression hautement différentielle à 5,5 hpf dans les embryons traités par U0126. Nous avons encore affiné notre sélection sur la base des catégories Gene Ontology (GO) (Données supplémentaires 2), en nous concentrant sur les facteurs de transcription et les gènes du développement (Tableau supplémentaire 6).

Pour la cartographie GO, les termes GO des gènes exprimés de manière différentielle associés à chaque comparaison ont été extraits de l'annotation du génome de référence d'O. fusiformis33 (disponible dans le référentiel https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). Les analyses d'enrichissement GO ont été mises en œuvre à l'aide du package GOseq R, en corrigeant le biais de longueur de gène62 et en analysant indépendamment les gènes régulés à la hausse et à la baisse. Les termes GO avec des valeurs p corrigées <0,05 ont été jugés significativement enrichis (Données supplémentaires 2). Une approche similaire a été suivie pour les analyses d'enrichissement de la voie de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG), en cartographiant les nombres KO représentés de manière différentielle à leur voie KEGG respective (Données supplémentaires 1).

Généralement, l'orthologie des gènes était basée sur l'annotation fonctionnelle du répertoire de gènes d'O. fusiformis, basée sur des recherches BLAST dans la base de données SwissProt et des recherches Panther (annotation fonctionnelle disponible dans le référentiel https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). Les séquences protéiques pour ERK1/2 et ERK5, les ligands WNT, RHOX et les homéoboîtes apparentées, les gènes DLL et JAGGED, FOXH et FOXF et FGFR et VEGFR ont été récupérées en explorant des transcriptomes et des bases de données accessibles au public. Plusieurs alignements de protéines (disponibles dans les données supplémentaires 1) ont été construits avec MAFFT v.7 en mode automatique63 et les régions mal alignées ont été supprimées avec gBlocks version 0.91b64. Les arbres de vraisemblance maximale ont été construits avec RAxML v.8.2.1165 ou FastTree66 et visualisés avec FigTree (https://github.com/rambaut/figtree/). InterProScan 567 a été utilisé pour effectuer la composition du domaine protéique de DLL.

Les gènes candidats (tableau supplémentaire 6) et les marqueurs de gènes utilisés pour caractériser les phénotypes de médicaments ont été amplifiés par deux cycles de PCR nichée à l'aide d'amorces spécifiques au gène et d'une amorce universelle T7 sur l'ADNc de stades de développement mixtes comme matrice initiale. Les ribosondes ont été synthétisées avec l'enzyme T7 (kit MEGAscript d'Ambion, #AM1334) et stockées dans un tampon d'hybridation à une concentration de 50 ng/μl à -20 °C. L'hybridation in situ colorimétrique et fluorescente entière a été réalisée selon un protocole établi3,30. Après les lavages de la sonde, les échantillons pour l'hybridation fluorescente in situ ont été incubés avec des fragments Fab anti-DIG-POD (ROCHE, #11633716001) et un anticorps de souris anti-α-tubuline acétylé (clone 6-11B-1, Millipore-446 Sigma, #MABT868, 1:500) pour co-colorer les limites cellulaires. Après développement du signal avec un kit d'amplification du signal Tyramide (Akoya Biosciences, #NEL742001KT), ces échantillons ont été lavés plusieurs fois dans du PTx et traités pour une incubation d'anticorps secondaire comme décrit ci-dessus. Pour caractériser in silico la dynamique de l'expression des gènes au cours du développement, nous avons utilisé un ensemble de données RNA-seq spécifique au stade disponible33, représentant l'expression moyenne des deux réplicats avec le package pheatmap v.1.0.12 disponible dans R, où l'intensité de la couleur montre la valeur z-score pour chaque gène.

Nous avons utilisé une combinaison de six marqueurs morphologiques et de six marqueurs moléculaires pour caractériser les phénotypes obtenus après tous les traitements médicamenteux (tableau supplémentaire 3). En bref, l'inspection visuelle et les projections z-stack d'images à balayage confocal ont été utilisées pour évaluer la présence de chaetae, d'intestin antérieur et postérieur, de muscles (dans l'intestin antérieur, les chaetoblastes et les releveurs), d'organe apical (avec touffe apicale de cils) et de neurones d'organe apical. Pour étayer la présence / l'absence de ces structures larvaires, nous avons évalué l'expression de marqueurs moléculaires spécifiques au type de cellule par hybridation colorimétrique in situ, à savoir six3/6 (ectoderme apical et œsophage), gsc (ectoderme oral antérieur), cdx (intestin postérieur), GATA4 / 5/6 (intestin moyen), torsion (mésoderme) et synaptotagmine-1 (neurones). Nous définissons le phénotype compressé comme une larve avec une morphologie et une structuration moléculaire comme un type sauvage mais avec un axe apico-ventral aplati. Le phénotype radial manque de structures et de marqueurs de l'intestin postérieur et mésodermique, et présente une expression radialisée du marqueur ectodermique oral gsc, avec un nombre réduit de neurones d'organe apical et d'organe apical. Le phénotype "tronqué" montre une symétrie bilatérale et tous les repères morphologiques d'une larve témoin, mais la région postérieure et le mésoderme sont sous-développés. La Fig. 3d supplémentaire montre des représentations schématiques des phénotypes témoins, compressés et radiaux et leurs repères morphologiques/moléculaires respectifs.

Des embryons et des larves représentatifs d'analyses colorimétriques ont été imagés avec un microscope à épifluorescence vertical Leica DMRA2 équipé d'une caméra Infinity5 (Lumenera), en utilisant une optique à champ clair et à contraste interférentiel différentiel. Les échantillons colorés par fluorescence ont été scannés avec un Leica SP5 LSCM. Les piles confocales ont été analysées avec Fidji et la luminosité/contraste et la balance des couleurs ont été ajustées dans Pixelmator Pro (v. 2.0.3) ou Photoshop (Adobe), en appliquant toujours les modifications à l'image entière et non à des parties de celle-ci. Les figures finales ont été conçues à l'aide d'Illustrator (Adobe).

Pour identifier les motifs de facteurs de transcription dans les régions accessibles à la chromatine autour des locus cdx et delta, nous utilisons deux analyses répliquées déjà disponibles pour la chromatine accessible à la transposase à l'aide de bibliothèques de séquençage (ATAC-seq)33 générées à partir de plus de 50 000 cellules de 850 à 900 coeloblastula à 5 hpf. En bref, les cellules ont été dissociées et lysées dans un tampon de lyse ATAC glacé (Tris-HCl 10 mM pH 7, 5, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, 0, 1% (v / v) IGEPAL, 0, 1% (v / v) Tween-20, 0, 01% (v / v) Digitonine) avec l'utilisation douce d'un pilon et incubées sur de la glace pendant 3 min. Après un lavage rapide avec du PBS glacé et une remise en suspension supplémentaire dans du tampon de lyse ATAC glacé, la réaction de lyse a été arrêtée avec un tampon de lavage ATAC glacé (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1 % (v/v) Tween-20) et mélangé en retournant doucement le tube trois fois. Les noyaux ont ensuite été culottés par centrifugation à 500 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse à angle fixe et la tagmentation de la chromatine et la préparation de la bibliothèque ont été effectuées selon le protocole Omni-ATAC68. La cartographie de lecture et l'appel de pic ont été effectués comme décrit ailleurs33, et l'enrichissement du motif du facteur de transcription et l'empreinte dans les régions accessibles à la chromatine ont été effectués avec HOMER v.4.1169 et TOBIAS v.0.12.070, respectivement, en utilisant des pistes de pics reproductibles entre les répliques (p <0,05) disponibles sur Gene Expression Omnibus avec le numéro d'accession GSE184126 et un référentiel public (https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome). Les pistes génomiques ont été tracées avec pyGenomeTracks v.2.171.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires. Toutes les données brutes de séquençage d'ARN-seq générées dans cette étude sont disponibles dans l'European Nucleotide Archive (ENA) sous le numéro d'accession PRJEB47195. De plus, cette étude a utilisé l'assemblage et l'annotation du génome d'Owenia fusiformis, disponibles à l'ENA sous l'accession GCA_903813345 et les pics ATAC-seq disponibles sur Gene Expression Omnibus avec le numéro d'accession GSE184126 et un référentiel public (https://github.com/ChemaMD/OweniaGenome).

Aucun code personnalisé n'a été utilisé dans cette étude.

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Nous remercions Ferdinand Marlétaz, Daria Gavriouchkina, Bruno Vellutini et tous les membres du laboratoire Martín-Durán pour leur soutien et leurs précieux commentaires sur le manuscrit, ainsi que Sandra Álvarez-Carretero pour son aide dans les analyses RNA-seq, le personnel de la Station Biologique de Roscoff pour son aide dans les collections et les fournitures animales, et l'Oxford Genomics Center du Wellcome Center for Human Genetics (financé par le Wellcome Trust grant reference 20314 1/Z/16/Z) pour la génération et le traitement initial des données de séquençage RNA-seq. Ce travail a été financé par une subvention de démarrage du Conseil européen de la recherche (numéro d'action 801669) à JMM-D. et une bourse d'études Queen Mary, Université de Londres à OS

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Océane Seudre, Allan M. Carrillo-Baltodano.

École des sciences biologiques et comportementales. Université Queen Mary de Londres, Mile End Road, E1 4NS, Londres, Royaume-Uni

Océane Seudre, Allan M. Carrillo-Baltodano, Yan Liang & José M. Martín-Durán

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OS, AMC-B. et JMM-D. conçu et conçu l'étude. OS, AMC-B., YL et JMM-D. effectué toutes les approches expérimentales et analysé de manière critique les données. OS, AMC-B. et JMM-D. écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et commenté le manuscrit.

Correspondance à José M. Martín-Durán.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Paschalis Kratsios et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Seudre, O., Carrillo-Baltodano, AM, Liang, Y. et al. ERK1/2 est un signal d'organisation ancestral dans le clivage en spirale. Nat Commun 13, 2286 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30004-4

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Reçu : 08 août 2021

Accepté : 11 avril 2022

Publié: 28 avril 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30004-4

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