Base structurelle de la régulation des lipides et du cuivre du transporteur ABC MsbA

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 7291 (2022) Citer cet article

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Une étape critique dans la biogenèse des lipopolysaccharides (LPS) consiste à retourner le lipooligosaccharide, un précurseur du LPS, du feuillet cytoplasmique au feuillet périplasmique de la membrane interne, une opération effectuée par le transporteur de cassette de liaison à l'ATP MsbA. Bien que la liaison du LPS à la cavité interne de MsbA soit bien établie, la sélectivité des interactions MsbA-lipides sur d'autres sites reste mal comprise. Ici, nous utilisons la spectrométrie de masse native (MS) pour caractériser les interactions MsbA-lipides et guider les études structurelles. Nous montrons que le transporteur co-purifie avec le cuivre(II) et que la liaison aux métaux module les interactions protéines-lipides. Une structure de résolution 2,15 Å d'une région N-terminale de MsbA en complexe avec du cuivre(II) est présentée, révélant une structure rappelant le peptide GHK, un chélateur de cuivre(II) de haute affinité. Nos résultats démontrent des affinités de liaison aux lipides dépendantes de la conformation, en particulier pour le précurseur du LPS, l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique (Kdo)2-lipide A (KDL). Nous rapportons une structure de résolution de 3,6 Å de MsbA piégée dans une conformation ouverte, tournée vers l'extérieur avec l'adénosine 5'-diphosphate et le vanadate, révélant un site de liaison KDL distinct, dans lequel le lipide forme des interactions étendues avec le transporteur. Des études supplémentaires fournissent des preuves que le site de liaison KDL extérieur est conservé et un modulateur allostérique positif de l'activité ATPase, servant de mécanisme d'activation prédictif pour coupler l'activité du transporteur avec la biosynthèse du LPS.

Une caractéristique déterminante de la plupart des bactéries Gram-négatives est la présence de lipopolysaccharide (LPS) dans le feuillet externe de la membrane externe1,2,3. Le LPS contribue à la formation d'une barrière imperméable qui aide les bactéries à résister aux antibiotiques et aux stress environnementaux2. La biogenèse du LPS commence dans le cytoplasme avec la production du lipooligosaccharide (LOS) précurseur du LPS, suivie d'un transport orchestré vers la surface cellulaire avec d'autres modifications (Fig. 1a)4. Le LOS contient un fragment lipide A conservé, un disaccharide bisphosphorylé de glucosamine (GlcN) avec quatre à sept chaînes acyle, qui est décoré avec du sucre d'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique (Kdo)1. Une décoration supplémentaire comprend la fixation d'un oligosaccharide central, qui varie selon les bactéries2. Le LOS cytoplasmique est basculé de l'intérieur vers le feuillet périplasmique de la membrane interne, une étape essentielle réalisée par le transporteur ATP-Binding Cassette (ABC) MsbA. Comme l'inhibition ou la délétion de MsbA est mortelle5, le transporteur est devenu une cible attrayante pour le développement d'antibiotiques. Des inhibiteurs de MsbA à petites molécules ont été récemment développés et leur mode d'action varie, comme le piégeage du transporteur dans une conformation tournée vers l'intérieur (IF) ou l'imitation de la liaison au substrat6,7,8,9,10.

a La biosynthèse des lipopolysaccharides commence dans le cytoplasme pour générer des lipooligosaccharides (LOS). Le LOS est composé d'une structure conservée de lipide A (gris), d'un disaccharide bisphosphorylé de glucosamine, modifié avec du sucre d'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique (Kdo) (orange) et d'un oligosaccharide central (violet), dont dépend de la bactérie. MsbA, alimenté par l'hydrolyse de l'ATP, retourne le LOS cytoplasmique du feuillet interne au feuillet externe de la membrane interne, une étape essentielle dans la biogenèse du LPS. Le LOS inversé est transporté vers la membrane externe avec des modifications supplémentaires pour devenir LPS. b Le spectre de masse natif des échantillons MsbA optimisés dans C10E5 donne un spectre de masse bien résolu. c Constantes de dissociation à l'équilibre (KD) pour les événements de liaison lipidique individuels à MsbA partiellement chargé. d Déconvolution du spectre de masse montré dans le panneau b. Les différentes espèces moléculaires correspondent à MsbA dimérique et à différents nombres d'ions cuivre liés. e La masse mesurée de MsbA après chargement avec du cuivre (II) montre la saturation de deux sites de liaison. f KD pour les événements de liaison lipidique individuels à MsbA entièrement chargé de cuivre (II). Sont rapportés la moyenne et l'écart type (n = 3, répétitions biologiques). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Un certain nombre d'études utilisant un arsenal de techniques biophysiques ont fourni un aperçu mécaniste et structurel de MsbA6,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. MsbA forme un homodimère, chaque sous-unité est constituée d'un domaine transmembranaire (TMD, six hélices transmembranaires par sous-unité) et d'un domaine de liaison aux nucléotides exposés au cytosol (NBD)21. Le mécanisme proposé par lequel MsbA transloque le LOS à travers la bicouche implique plusieurs étapes6,17. L'apo ou l'adénosine 5'-diphosphate (ADP) MsbA lié remplit une conformation IF avec les NBD séparés dans l'espace, favorisant l'entrée et la liaison du LOS volumineux. La liaison du LOS dans la cavité centrale et intérieure et l'adénosine 5'-triphosphate (ATP) à MsbA favorise la dimérisation des NBD. L'hydrolyse de l'ATP alimente un changement de conformation en une conformation tournée vers l'extérieur (OF), transportant le LOS vers le côté périplasmique de la membrane interne. Le LOS et le phosphate inorganique sont libérés et le cycle de MsbA revient à une conformation IF. Comme beaucoup d'autres transporteurs ABC, l'activité ATPase de MsbA est stimulée en présence de différents substrats, en particulier les espèces lipidiques A hexaacylées, telles que l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique (Kdo)2-lipide A (KDL)22,23,24. Bien que la reconnaissance hautement sélective du LPS dans la cavité interne par MsbA soit bien comprise6,17, la base structurelle de la stimulation de l'activité ATPase de MsbA pour les lipides se liant à d'autres sites reste mal comprise.

La spectrométrie de masse native (MS) est devenue une technique biophysique indispensable pour étudier les complexes protéiques membranaires et leurs interactions avec les lipides et d'autres molécules25. Avec la capacité de préserver les interactions non covalentes et la structure de type natif des protéines membranaires en phase gazeuse26,27, la technique a fourni des informations pertinentes sur diverses interactions biochimiques, notamment la liaison des nucléotides, des médicaments, des peptides et des lipides, ainsi que des données thermodynamiques pour les interactions protéine-protéine, protéine-ligand et protéine-lipide28,29,30,31,32,33,34,35. Dans cette étude, nous avons cherché à caractériser les interactions MsbA-lipides dans différents états conformationnels : apo, face vers l'intérieur ; et piégé par le vanadate, orienté vers l'extérieur. Les études de MS natives révèlent que MsbA co-purifie avec le cuivre (II), mais également que les interactions MsbA-lipides sont directement influencées par la liaison au métal et la conformation des protéines. Des études structurelles révèlent un site de liaison KDL qui n'a pas été observé auparavant dans d'autres structures ABC. Nos découvertes apportent de nouvelles informations sur la régulation des métaux et des lipides de MsbA.

Comme il a été rapporté que MsbA co-purifie avec le LPS et d'autres lipides17,36, notre premier objectif était d'optimiser la purification de MsbA à partir d'E. coli pour les études sur la SEP native. Le spectre de masse de MsbA purifié dans le détergent n-dodécyl-β-D-maltopyranoside (DDM) était une large bosse (Figure 1 supplémentaire), indiquant un échantillon hautement hétérogène, correspondant à une batterie de contaminants à petites molécules co-purifiés. Les pics spectraux de masse pointus décorant la bosse sous-jacente, centrés autour de 4500 m/z, correspondent au MsbA monomère, résultant de la dissociation de l'homodimère dans des conditions non natives à haute activation. Après avoir utilisé une méthode de criblage de détergent établie pour optimiser la purification des protéines (voir la note supplémentaire 1) 37, les échantillons de MsbA solubilisés dans le détergent à base de pentaéthylène glycol monodécyléther (C10E5) présentaient un spectre de masse bien résolu (Fig. 1b). Les échantillons de MsbA ont également hydrolysé l'ATP au fil du temps, comme en témoigne la présence d'ADP, tandis que MsbA contenant la mutation E506Q, qui supprime l'activité catalytique, n'a pas transformé l'ATP (Fig. 1c – d supplémentaire). Fait intéressant, différentes espèces moléculaires sont mesurées, correspondant au MsbA dimérique et à l'ajout d'un à trois adduits ~ 65 Da (Fig. 1d et Tableau supplémentaire 1). L'analyse d'échantillons de MsbA à l'aide de la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) a identifié les adduits liés comme du cuivre (tableaux supplémentaires 2 à 3). L'ajout de cuivre (II) à MsbA a saturé les deux sites de liaison (Fig. 1e). L'élimination de l'excès de cuivre (II) ni l'ajout du chélateur de cuivre (II), la trientine39 a réduit la quantité de métal lié à MsbA (Fig. 2 supplémentaire). Ces résultats révèlent que MsbA possède un site de liaison au cuivre (II) de haute affinité par sous-unité.

Pour mieux comprendre les interactions MsbA-lipides, nous avons déterminé les constantes de liaison à l'équilibre pour la liaison de MsbA à différents lipides. Pour ces études, nous avons sélectionné la 1,1′,2,2′-tétraoléoyl-cardiolipine (TOCDL, 72:4) ou l'acide phosphatidique (PA), la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), le phosphatidylglycérol (PG) et la phosphatidylsérine (PS) contenant la composition de la chaîne acyle, 1-palmitoyl-2-oléoyle (PO, 16:0- 18:1). Nous avons également inclus l'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonique (Kdo)2-lipide A (KDL), un précurseur de LPS connu pour stimuler l'activité MsbA ATPase22,23,24. À l'exception du PC, ces lipides se trouvent dans E. coli40. MsbA partiellement et entièrement chargé en cuivre (II) a été titré avec chaque lipide, suivi de l'enregistrement de leurs spectres de masse natifs (Figs. 3 à 6 supplémentaires). Les fractions molaires des états liés à l'apo et aux lipides de MsbA ont été extraites des données MS déconvoluées et utilisées pour déterminer la constante de dissociation à l'équilibre (KDN) pour le Nème événement de liaison (tableaux supplémentaires 4 à 5). MsbA chargé de cuivre (II) a entraîné une amélioration statistiquement significative des affinités de liaison pour POPA et POPS (Fig. 1c – f et Fig. 7 supplémentaire). Les deux lipides de liaison les plus étroits pour MsbA chargé de cuivre (II) étaient le TOCDL (KD1 = 1, 6 µM) et le KDL (KD1 = 0, 6 µM). Les affinités de liaison au POPG étaient largement indépendantes de l'état lié au cuivre (II) de MsbA. En bref, ces résultats démontrent que MsbA se lie non seulement sélectivement aux lipides, mais dépend également du degré de cuivre (II) lié au transporteur.

Deux sites de liaison métalliques putatifs pour un MsbA ont déjà été signalés41. La mutation de l'un des sites putatifs (H562A et H576A) n'a pas aboli la liaison du cuivre (II) (Fig. 2 supplémentaire). Après avoir soigneusement inspecté les structures de MsbA en mettant l'accent sur les résidus d'histidine et de cystéine, qui sont tous deux connus pour coordonner préférentiellement le cuivre42, nous avons noté que dans toutes les structures de MsbA, l'histidine N-terminale n'est pas observée, ce qui est probablement dû à un lieur flexible ou au peuplement de différentes structures. L'élimination des quatre premiers résidus (Met-His-Asn-Asp) de MsbA a supprimé la liaison du cuivre (II) (Fig. 2a), fixant le site de liaison du métal à l'extrémité N-terminale. Des études supplémentaires montrent que la protéine tronquée sans cuivre (II) ne présente pas d'activité ATPase altérée dans le détergent ni les protéoliposomes (Figure 8 supplémentaire). Comme il a été démontré que la Met initiatrice était supprimée pour certaines protéines bactériennes, nous avons exprimé et purifié MsbA avec une étiquette d'affinité C-terminale et nous avons constaté qu'elle conserve une extrémité N-terminale intacte qui peut également se lier au cuivre (II) (Figure supplémentaire 2). Fait intéressant, les simulations MD44 montrent que l'extrémité N-terminale de MsbA dans différentes structures est située près de la membrane interne et dans une région où le LOS pourrait passer avant d'entrer dans la cavité intérieure (Fig. 2b et Figure supplémentaire 9).

a Spectre de masse natif et déconvolution de MsbA avec délétion de quatre résidus N-terminaux. Aucun cuivre(II) n'est lié au transporteur tronqué. b Instantané d'une simulation de dynamique moléculaire de MsbA dans une bicouche 16: 0 PC (DPPC) (PDB 6BPP téléchargé depuis MemProtMD44). DPPC est représenté en bâton (gris). La protéine est représentée sous forme de bande dessinée avec les résidus 4 à 8 colorés en rose. La boîte jaune met en évidence l'emplacement de l'extrémité N-terminale par rapport à la membrane interne. c Structure de l'extrémité N-terminale de MsbA (résidus 1 à 4) fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP) coordonnant le cuivre (II). Le peptide N-terminal est représenté en bâton avec de l'eau (bleu) et du cuivre (II) représentés sous forme de sphères. Les obligations sont représentées par des lignes pointillées (limon). Pic de différence anormal affiché en magenta et contourné à 15 sigma. La structure de GFP est omise pour plus de clarté. d Alignement du peptide MsbA N-terminal lié au cuivre (II) avec le complexe GHK-cuivre (II) (CCDC-809108, Cα coloré en violet).

Pour faciliter la détermination de la structure, la séquence N-terminale de MsbA a été greffée sur des protéines connues pour cristalliser facilement. La MS native montre ces protéines de fusion contenant un fragment de l'extrémité N-terminale de MsbA de longueur variable lié au cuivre (II) et monomère (Fig. 10 supplémentaire). L'une des fusions de protéines fluorescentes vertes (GFP), contenant les résidus 1 à 4 de MsbA, a produit des cristaux de qualité radiographique qui ont conduit à la détermination de la structure à une résolution de 2, 15 Å (tableau supplémentaire 6). La densité électronique résolue pour l'extrémité N-terminale est observée avec un fort signal anormal pour l'ion cuivre lié (Fig. 2c et Fig. 11 supplémentaire) et adopte une structure similaire à celle du peptide GHK coordonné au cuivre (II), un chélateur naturel de cuivre (II) à haute affinité trouvé dans le plasma sanguin (Fig. 2d) 45 . Le cuivre(II) adopte une coordination pseudo-octaédrique avec les ligands plans composés de l'amine de M1, de l'amide et de la chaîne latérale de H2. Une interaction supplémentaire est formée par la chaîne latérale de D197 'à partir d'une molécule liée à la symétrie (Fig. 10c supplémentaire) et similaire à la structure GHK-cuivre (II), dans laquelle est un carboxylate C-terminal. Les ligands axiaux du cuivre (II) sont l'eau, dont l'un forme un pont entre le cuivre et la chaîne latérale et l'amide de N3. Cette interaction représente un contact cristallin et la coordination diffère du peptide GHK dans les eaux axiales et N3 participant à un pont d'eau vers l'ion métallique (Fig. 2d)46. La différence entre les deux structures suggère que la troisième position peut être variable. Compte tenu de la proximité de l'extrémité N-terminale avec le feuillet interne (Fig. 2b et Fig. 11 supplémentaire), la structure liée au cuivre (II) pourrait engager le groupe de tête lipidique, ce qui améliorerait l'affinité de liaison aux lipides. L'analyse des séquences de transporteurs ABC révèle que plus de 400 protéines contiennent une histidine en deuxième position, dont certaines avec une séquence N-terminale de MHK, et peuvent avoir une pertinence pour d'autres transporteurs ABC.

Pour déterminer l'impact de la conformation de MsbA sur l'affinité de liaison aux lipides, des expériences analogues ont été réalisées en utilisant MsbA piégée dans une conformation OF ouverte avec de l'adénosine diphosphate (ADP) et du vanadate (VO4). La mesure de la masse native montre que chaque sous-unité du transporteur est liée aux molécules de cuivre (II), d'ADP et de VO4 (Fig. 3a et Tableau supplémentaire 1). Les constantes de dissociation ont révélé que MsbA dans la conformation ouverte OF présentait une affinité de liaison aux lipides plus élevée pour un sous-ensemble de lipides (Fig. 3d et Fig. 12–14 supplémentaires, et Tableau supplémentaire 7). Par exemple, en présence de 0, 4 μM de KDL, le MsbA piégé au vanadate se lie jusqu'à deux lipides alors que la protéine non piégée ne se lie qu'à un seul KDL (Fig. 3b – c). En particulier, l'affinité de liaison pour KDL (KD1 = 0, 3 µM) a été multipliée par deux par rapport à la protéine non piégée (Fig. 3d). Fait intéressant, le changement de KD pour chaque événement de liaison lipidique ultérieur a été significativement réduit, une indication d'une forte coopérativité positive. La liaison de POPC et POPE rappelle celle de MsbA partiellement chargée en cuivre(II). POPA et POPG ont affiché une augmentation globale modeste de l'affinité de liaison. Ensemble, ces résultats démontrent que différents états conformationnels de MsbA se lient aux lipides avec différentes affinités.

a Spectre de masse représentatif de MsbA piégé avec ADP·VO4 et en présence de 0,4 μM de KDL. b Déconvolution du spectre de masse montré dans le panneau a. c Spectre de masse déconvolué de MsbA non piégé en présence de la même quantité de KDL. Une réduction significative de la liaison de KDL à MsbA est observée. d Valeurs KD pour les événements de liaison lipidique individuels à MsbA piégé avec ADP et vanadate. La moyenne et l'écart type (n = 3, répétitions biologiques) sont indiqués. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Comme KDL lie le MsbA lié au cuivre (II) avec une affinité supérieure aux autres lipides, nous avons préparé MsbA piégé avec de l'ADP et du vanadate (62 µM) en présence d'un excès molaire double de KDL (124 µM) dans C10E5 pour des études de cryo-microscopie électronique (cryoEM). La structure du complexe a été déterminée à une résolution de 3, 6 Å (Fig. 4a, Fig. 15–16 supplémentaires, Tableau supplémentaire 8 et Note supplémentaire 2). La structure est similaire à celle du MsbA piégé au vanadate de S. typhimurium, mais diffère des structures de MsbA occluses et piégées au vanadate décrites précédemment, en grande partie dans le TMD (Fig. 17 supplémentaire). Une densité supplémentaire est observée centrée sur TM5 dans une région du feuillet cytoplasmique de la membrane interne, dans laquelle KDL pourrait être directement modélisé dans cette densité (Fig. 4a). L'emplacement de KDL est différent du site de liaison intérieur6,17 et du site de liaison extérieur putatif19 situé sur le côté opposé de la membrane interne (Fig. 5). La surface électrostatique de MsbA montre que le groupe de tête de KDL est lié à un grand patch basique (Fig. 4b). Les chaînes acyle de KDL pourraient être modélisées, qui interagissent avec la surface hydrophobe de MsbA (Fig. 4c). Des interactions étendues se forment entre KDL et MsbA avec une surface d'interface de 2779 Å2. Les substituants caractéristiques de la phosphoglucosamine (P-GlcN) du LOS sont coordonnés par R238 d'un côté et R188 et K243 de l'autre côté (Fig. 4d). De plus, R236, Q240 et K243 interagissent avec l'un des groupes Kdo de LOS (Fig. 4d). Nous notons également que la concentration de KDL utilisée ici est bien inférieure à celle utilisée pour les structures de G907 lié à MsbA ou de TBT1, dans lesquelles 1 mM et 400 µM du médicament respectif ont été utilisés6,8. Cela renforce encore la liaison spécifique de KDL au site extérieur. De plus, il existe une densité claire pour l'ADP·VO4 dans les NBD, coordonnée par un réseau de résidus conservés (Fig. 4e et Fig. 18 supplémentaire). En bref, le site de liaison KDL extérieur identifié ici peut jouer un rôle dans la régulation de la fonction MsbA.

une reconstruction Cryo-EM (3,6 Å) de MsbA(ADP·VO4) en complexe avec KDL. La densité de KDL est indiquée en jaune et les sous-unités MsbA sont indiquées en rose et bleu. b Le potentiel électrostatique coulombien (barre d'échelle -10 à +10 calculée par ChimeraX62) est coloré en rouge et bleu pour les charges négatives et positives, respectivement. Le KDL et les résidus en interaction sont représentés sous forme de balle et de bâton. c MsbA illustré avec des surfaces hydrophiles et hydrophobes colorées respectivement en bleu et or. d Différentes vues de KDL liées à MsbA. KDL et résidus en interaction représentés en bâton. Les obligations sont représentées par des lignes jaunes en pointillés. Les résidus sont étiquetés. e Vue de l'ADP·VO4 lié et des résidus en interaction présentés comme décrit en d.

Les structures sont montrées dans la représentation de bande dessinée avec le lipide (si présent) montré dans les sphères oranges. Deux vues sont présentées (0 et 90°). Montré est le site de liaison extérieur a (ce travail), le site de liaison intérieur b (PDB 6BPL) 6, 17 et le site de liaison extérieur putatif c (PDB 6BL6) 19, 64. Dans le panneau c, la densité n'était pas suffisamment claire pour modéliser le lipide et le site putatif est indiqué par un cercle rouge19. d Logo de séquence des résidus interagissant avec KDL (83, 87, 188, 236, 238, 240 et 243) basé sur un alignement de 258 séquences MsbA de toute la phylogénie bactérienne.

Le site de liaison KDL unique découvert ici révèle une caractéristique conservée au cours de l'évolution de MsbA. Les résidus (R188, R238 et K243) qui engagent les substituants P-GlcN caractéristiques de LOS sont conservés (Fig. 5d). Des interactions similaires ont été observées pour le site LOS intérieur dans MsbA6,17 et la reconnaissance du LPS dans LptB2FG, un transporteur LPS ABC48. D'autres résidus (R236 et Q240) qui coordonnent un groupe Kdo de KDL sont également conservés (Fig. 5d). Comme la plupart des LOS de bactéries gram-négatives synthétisent une molécule de KDL ressemblant à celles trouvées dans E. coli3, la conservation des résidus et leur interaction avec la KDL en font une caractéristique unique de MsbA par rapport aux autres transporteurs. De plus, le grand patch basique qui abrite le groupe de tête KDL s'étend au-delà des groupes Kdo qui pourraient engager davantage l'oligosaccharide central de LOS, le glycolipide MsbA flips. Ce patch de base s'étend probablement à d'autres MsbA et est important pour la reconnaissance du LOS, y compris d'autres lipides, dont la structure varie selon les bactéries2.

Une série de mutants MsbA conçus pour avoir un impact sur la liaison KDL ont été évalués. Certaines des protéines mutantes MsbA ont pu être exprimées et purifiées, mais étaient biochimiquement instables lorsque la troncature du transporteur a été observée après traitement au vanadate, comme MsbAY87F, R238A (Figure 19 supplémentaire). MsbA contenant les mutations R188A et K243A (MsbAR188A, K243A), conçues pour perturber l'interaction avec l'un des substituants P-GlcN de KDL, était biochimiquement stable et adaptée à la détermination des KD (Fig. 6a – c et Supplémentaire Fig. 20). Pour la protéine non piégée, KD1 a augmenté de deux fois et KD2 a augmenté de cinq fois. Dans l'état piégé, KD1 et KD2 ont également augmenté statistiquement de plus de deux fois. Comme MsbA est connu pour être stimulé par certains lipides22,23,24,49, nous avons déterminé l'activité ATPase de MsbA en l'absence et en présence de lipide (Fig. 6d). La MsbA de type sauvage a été stimulée par le KDL à des niveaux observés par d'autres17,22. Cependant, RaLPS (LRa), un LOS avec un noyau complet de type E. coli R250, a stimulé l'activité MsbA ATPase à un degré plus élevé (Fig. 6d)22. Conformément à un rapport précédent22, le lipide A (LA), similaire au KDL mais dépourvu des substituants Kdo, a stimulé MsbA mais dans une moindre mesure, soulignant l'importance des groupes Kdo. MsbAR188A, K243A a présenté une diminution statistiquement significative de la stimulation indépendante du type de lipide (Fig. 6d). La stimulation induite par les lipides de MsbA contenant les mutations R78A et K299A (MsbAR78A, K299A), conçues pour perturber la liaison au site intérieur (Fig. 5b), a également été évaluée. MsbAR78A, K299A n'a montré aucune stimulation par LA et KDL mais l'activité a été stimulée par LRa au même niveau que la protéine de type sauvage (Fig. 6d). Ensuite, nous avons inspecté les résidus coordonnant KDL dans les structures MsbA (Fig. 6e et Fig. 21 supplémentaire). À l'exception de R188, les résidus d'interaction KDL sont dans des positions similaires. Cependant, dans les états OF (occlus et ouverts), TM4 est déplacé d'environ 12 Å dans une direction vers les autres résidus, amorçant R188 pour engager le P-GlcN de KDL. Cette interaction supplémentaire explique l'amélioration de l'affinité de liaison KDL. Ensemble, ces résultats indiquent que le site de liaison KDL extérieur a un rôle direct dans la stimulation allostérique de l'activité MsbA ATPase.

un spectre de masse déconvolué de 0,3 μM MsbAR188A,K243A en présence de 0,4 μM KDL. b Spectre de masse déconvolué de 0, 4 μM de MsbAR188A, K243A piégé au vanadate avec la même concentration de KDL que dans le panneau a. c Valeurs KD pour la liaison de KDL à la MsbA de type sauvage et mutante. d Activité ATPase de MsbA, MsbAR188A, K243A et MsbAR78A, K299A en présence et en l'absence de 5 μM de lipide A (LA) (*p = 0,047 ; 0,011), de KDL (**p = 0,008 ; 0,005, *p = 0,019) ou de Ra-LPS (LRa) (**p = 0. 004 ; 0,009). Un test t de Student bilatéral a été utilisé pour tester la signification statistique. e Alignement de différentes structures sur une région de TM5, gamme de résidus de 230 à 250. Les quatre premiers panneaux illustrés (de gauche à droite) correspondent à l'apo (ce rapport), au G907 lié (PDB 6BPL) et au vanadate piégé dans une structure MsbA occluse (PDB 7BCW) ou ouverte (ce rapport). Le panneau le plus à droite est une superposition des quatre structures. La moyenne et l'écart type (n = 3, répétitions biologiques) sont indiqués. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

En résumé, les données de spectrométrie de masse native révèlent que MsbA co-purifie avec le cuivre (II), une observation qui resterait inaperçue avec les méthodes traditionnelles, et les interactions protéine-lipide sont directement influencées par la liaison du cuivre (II) ainsi que la conformation du transporteur. Des études structurelles montrent que l'extrémité N-terminale de MsbA coordonne le cuivre (II) de la même manière que le peptide GHK. La liaison du cuivre (II) à MsbA a un impact sur la liaison lipidique et l'extrémité N-terminale est située près de la bicouche où elle interagit de manière plausible avec les groupes de tête lipidiques. Plus largement, la liaison du cuivre (II) peut avoir un rôle régulateur, tel que le couplage des niveaux de cuivre (II) avec la biogenèse du LPS, et justifie une enquête plus approfondie. Une autre structure illumine un site de liaison KDL extérieur distinct est un modulateur allostérique de l'activité ATPase et une caractéristique conservée de MsbA. Des études de mutagenèse documentent que ce site allostérique extérieur est également sensible aux espèces lipidiques A hexaacylées, telles que LA et LRa. Ces résultats fournissent des preuves convaincantes d'un mécanisme d'activation par anticipation pour MsbA, un principe de contrôle rare dans les voies de biosynthèse qui est mieux décrit pour la pyruvate kinase51, ajustant l'activité de MsbA pour correspondre à la production cellulaire de LOS cytoplasmique et de ses précurseurs.

Le gène msbA (UniProt P60752) et le plasmide pCDF-1b (Novagen) ont été amplifiés par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à l'aide de l'ADN polymérase Q5 haute fidélité (New England Biolabs, NEB) de l'ADN génomique d'Escherichia coli et du plasmide purifié, respectivement. Les amorces ont été conçues à l'aide de l'outil d'assemblage NEBuilder (NEB) en ligne et les produits amplifiés ont été purifiés sur gel avant l'assemblage d'ADN HiFi (NEB) conformément au protocole du fabricant. La construction résultante, pCDF-MsbA, exprimait MsbA avec une protéine de fusion His6 clivable par TEV N-terminal. Pour générer des formes mutantes de MsbA, des amorces ont été conçues à l'aide de l'outil en ligne NEBaseChanger (NEB) et des mutants introduits à l'aide du mélange d'enzymes KLD (NEB) selon le protocole du fabricant. MsbA a également été cloné dans un plasmide pET15 modifié pour exprimer MsbA avec une fusion C-terminale clivable par la protéase HRV3C avec le superdossier GFP52 suivi d'une étiquette His 6x. La séquence N-terminale de MsbA a été greffée sur MBP, le superdossier GFP52 et le lysozyme T4 par sous-clonage dans le plasmide pCDF-MsbA et en conservant les résidus 1 à 8 de MsbA. Une stratégie de fusion similaire a été réalisée pour le peptide GHK53. La troncation de l'extrémité N-terminale de MsbA a été réalisée à l'aide d'un mélange d'enzymes KLD (NEB) selon le protocole du fabricant. La fusion GFP pour une détermination de structure réussie avait une séquence N-terminale après clivage par la protéase TEV de MHNDKGEELF avec la séquence MsbA soulignée. Tous les plasmides ont été confirmés par séquençage d'ADN. Les amorces utilisées dans cette étude se trouvent dans le fichier de données source.

Les plasmides d'expression MSBA de type sauvage et mutants ont été transformés en cellules compétentes E. coli (DE3) BL21-AI (Invitrogen) et incubées à 37 ° C jusqu'à l'OD600 nm ≈ 0,6-1,0, à quel point les cultures ont été induites avec des concentrations finales de 0,5 mm IPTG (Isopropyl β-1-thiogalactopryanoside) et 0,2%. Les cultures ont été induites pendant une nuit à 25°C. Les cultures ont ensuite été récoltées à 4500 × g pendant 12 min et le culot résultant a été remis en suspension dans Tris 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7, 4 et complété avec un comprimé Roche cOmplete Protease Inhibitor Cocktail. La suspension a été lysée dans un microfluidiseur Microfluidics M-110P fonctionnant à 25 000 psi sur de la glace. Le lysat a été centrifugé à 40 000 × g pendant 20 min et le surnageant résultant a été centrifugé à 100 000 × g pendant 2 h. Les pastilles résultantes ont été recueillies et homogénéisées dans Tris 20 mM, NaCl 150 mM, glycérol à 20 % (v/v), pH 7,4. La solution de membrane a été extraite avec 1 % (p/v) de DDM, en tournant pendant une nuit à 4 °C. L'extraction a ensuite été centrifugée à 40 000 × g pendant 10 min et le surnageant résultant a été additionné d'imidazole 10 mM et filtré avec un filtre seringue de 0,45 µm.

Le matériau extrait a été soumis à un criblage approfondi de détergents37 pour déterminer la capacité délipidante de chaque détergent sur MsbA. En bref, le MsbA marqué His a été lié à 100 µL de billes Ni-NTA (Qiagen) équilibrées avec du tampon NHA (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 10 % (v/v) glycérol, pH 7,4) additionné de 2x la concentration micellaire critique (CMC) de DDM, puis lavé avec 5 volumes de colonne (CV) de NHA contenant 2x CMC D Tampon DM. La protéine liée a ensuite été traitée avec 10 CV de NHA contenant des tampons 2x CMC DDM additionnés de 10x CMC de divers détergents (Anatrace). La colonne a ensuite été rééquilibrée avec 5 CV de tampon NHA-2x CMC DDM et éluée avec 2 CV de tampon NHA contenant 2x CMC DDM additionné de 500 mM d'imidazole. Pour vérifier le degré de délipidation par spectrométrie de masse native, l'éluant a été échangé avec du tampon dans de l'acétate d'ammonium 200 mM, 2x CMC DDM, pH 7,4 via des colonnes de centrifugeuse sur gel Micro Bio-Spin P-6 (Biorad) selon le protocole du fabricant. Après détermination et purification avec le lavage au détergent optimal (NG), la protéine a été remplacée par du tampon dans NHA-2x CMC DDM sur une colonne de dessalement HiPrep 26/10 (GE Healthcare). L'échantillon a ensuite été traité avec la protéase TEV, produite en interne, pendant une nuit à température ambiante pour éliminer l'étiquette His N-terminale, 10 mM de β-mercaptoéthanol ont été ajoutés pendant le traitement TEV. Le matériau digéré a été passé sur de l'agarose Ni-NTA équilibré avec NHA-2x CMC DDM et l'écoulement contenant le matériau clivé a été collecté. Le matériau a été concentré à l'aide d'un concentrateur centrifuge (Millipore, seuil de poids moléculaire de 100 kDa) suivi d'une injection sur une colonne Superdex 200 Augmentation 10/300 GL (GE Healthcare) équilibrée avec 20 mM HEPES, 200 mM NaCl, 10 % (v/v) glycérol et 2x CMC C10E5. Les fractions maximales contenant du MsbA dimérique ont été regroupées et congelées instantanément à -80 ° C.

Pour MsbA avec une liaison réduite du cuivre (II), du MgCl2 1 mM supplémentaire a été ajouté à toute la solution de tampon et de MsbA lors de l'étape de purification à l'aide de billes de Ni-NTA. Le MsbA saturé en cuivre (II) a été obtenu en ajoutant 20 uM d'acétate de cuivre (II) puis en échangeant le tampon à l'aide d'une colonne Bio-Spin pour éliminer l'excès de cuivre (II). MsbA piégé par le vanadate a été obtenu en ajoutant de l'ATP et du MgCl2 à MsbA pour atteindre la concentration finale de 10 mM pour les deux puis en incubant à température ambiante pendant 10 min. Après incubation, du vanadate (pH 10) a été ajouté pour atteindre la concentration finale de 1 uM suivi d'une incubation à 37 ° C pendant 10 min. Les échantillons de MsbA ont été échangés avec un tampon à l'aide d'une colonne Bio-Spin avec de l'acétate d'ammonium 200 mM additionné de 2x CMC C10E5 pour les études sur la SP native. Pour préparer des échantillons de MsbA pour les études Cryo-EM, MsbA et MsbA piégé ont été préchargés avec du cuivre (II) puis purifiés par une colonne d'exclusion de taille Superdex 200 Augmentation 10/300 GL équilibrée avec 200 mM NaCl, 20 mM HEPES et 2x CMC C10E5 sans glycérol. Les fractions de pic contenant MsbA ont été regroupées et concentrées à 8 mg/mL puis mélangées avec du KDL à un rapport molaire de 1:2 (1 KDL pour 1 sous-unité MsbA).

Les échantillons ont été chargés dans des capillaires en verre recouverts d'or fabriqués en interne37 et ont été ionisés par électrospray dans un Thermo Scientific Exactive Plus Orbitrap avec plage de masse étendue (EMR). Pour l'analyse de masse native, l'instrument a été réglé comme suit : décalage CC de source de 25, CC d'injection flatapole à 8,0 V, lentille interflatapole à 7, CC flatapole courbé à 6,0, transfert CC multipolaire à 2 et lentille d'entrée du piège C à 2, pression de gaz de piégeage à 6,0 avec le CID dans la source à 60,0 eV et CE à 100, tension de pulvérisation à 1,70 kV, température capillaire à 200 °C, temps d'injection maximum à 200 ms. Les spectres de masse ont été acquis avec un réglage de résolution de 17 500, des microscans de 1 et une moyenne de 100.

Les lipides ont été préparés comme décrit précédemment54, dans lequel les lipides dissous dans du chloroforme ont été séchés sous un flux d'azote placé sous vide pendant une nuit suivi d'une dissolution dans l'eau. La concentration de MsbA a été déterminée à l'aide d'un test de protéine DC (BioRad) avec de l'albumine de sérum bovin comme standard. MsbA a été incubé avec des lipides à des concentrations variables et mélangé avec de l'acétate d'ammonium 200 mM additionné d'oxyde de lauryldiméthylamine 2x CMC (LDAO) à un rapport volumique de 1: 1. Les échantillons ont été incubés dans la chambre de la source d'ionisation nano électrospray pendant une minute pour atteindre l'équilibre avant l'acquisition des données. Ces échantillons ont été analysés sur le spectromètre de masse Orbitrap Exactive Plus EMR (Thermo Scientific) fonctionnant avec des paramètres identiques à ceux décrits ci-dessus. Les spectres de masse pour chaque événement de titrage ont été obtenus en triple. Les spectres de masse ont été déconvolués à l'aide d'UniDec55 et les intensités maximales résultantes pour l'apo et la protéine liée aux lipides ont été déterminées. L'abondance relative pour chaque espèce a été déterminée en divisant l'intensité maximale par l'intensité totale à convertir en fraction molaire pour chaque expérience indépendante. Pour MsbA (P) se liant au Nième lipide (Ln), nous avons appliqué le modèle de liaison lipidique séquentielle suivant :

où:

Pour calculer la fraction molaire d'une espèce particulière54 :

Pour chaque titrant dans le titrage, la concentration libre de lipide a été calculée comme suit :

Le modèle séquentiel de liaison lipidique a été globalement adapté aux données de la fraction molaire en minimisant la fonction pseudo-\({\chi }^{2}\) :

où n est le nombre de ligands liés et d est le nombre de points de données de fraction molaire expérimentale.

Des échantillons de MsbA ont été soumis au laboratoire d'analyse élémentaire de la Texas A&M University pour une analyse élémentaire par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif. Un spectromètre de masse NexION ICP (PerkinElmer) a été utilisé avec les paramètres de fonctionnement fournis dans le tableau supplémentaire 2.

Le POPC (Avanti) a été remis en suspension dans du chloroforme et séché sous un courant d'azote gazeux. Le film a été lavé avec du pentane et séché à nouveau sous un courant d'azote gazeux. Le film lipidique a été stocké dans un dessiccateur pendant une nuit et réhydraté à une concentration finale de 20 mM dans un tampon de réhydratation (HEPES 20 mM pH 7,4, KCl 150 mM), agité occasionnellement pendant une heure puis stocké à -80 ° C. Le mélange de liposomes (~150 μL) a été dilué de moitié avec le tampon de réhydratation et extrudé à l'aide d'une mini-extrudeuse (Avanti Polar Lipids) avec une membrane en polycarbonate de 100 nm jusqu'à ce que la solution devienne translucide. Les liposomes extrudés ont ensuite été séparés en deux portions différentes de volume égal : une pour la protéine de type sauvage et une pour le mutant. Les liposomes extrudés ont ensuite été solubilisés avec un volume égal de tampon de solubilisation (HEPES 20 mM, pH 7,4, KCl 150 mM et DDM 20 mM) et mis en rotation à température ambiante pendant 30 min ou jusqu'à ce qu'ils soient clairs. Les échantillons de MsbA ont ensuite été ajoutés à un rapport protéine/lipide de 1:100 (p/p) et mis en rotation pendant une heure à température ambiante. Des BioBeads ont été ajoutées aux liposomes et mises en rotation pendant une nuit à 4 ° C pour éliminer le détergent.

L'activité ATPase de MsbA a été déterminée à la suite d'une version modifiée du test au vert de malachite56. Pour la protéine entièrement délipidée (apo), 400 nM de MsbA (dans de l'acétate d'ammonium 200 mM additionné de 1x CMC C10E5 et 1x CMC LDAO) ont été incubés avec 5 mM MgCl2 et 200 μM ATP à 37 ° C pendant 12 min. Pour l'analyse des protéines avec KDL, le lipide a été ajouté à l'échantillon à une concentration finale de 5 uM. Les échantillons de point final ont été prélevés à 3, 6, 9, 12 min et arrêtés avec l'ajout d'une solution de vert malachite avec les composants suivants : mélange 3:1 de 0,045 % (p/v) de vert malachite et 4,2 % (p/v) de molybdate d'ammonium préparé dans 4 N HCl, 0,04 % (v/v) Triton X-100 (concentration finale). Ensuite, du citrate de sodium à 34 % (p/v) a été ajouté pour arrêter la réaction de coloration. Les réactions désactivées ont été incubées à température ambiante pendant 30 min et l'absorbance à 650 nm a été mesurée sur un lecteur de plaque CLARIOstar (BMG LabTech). Le taux d'hydrolyse de l'ATP a été obtenu en traçant la pente d'absorbance des échantillons prélevés à 3, 6, 9 et 12 min.

Des essais initiaux de cristallisation ont été effectués pour la protéine de fusion GFP à une concentration de 1 mM (en utilisant un coefficient d'extinction à 490 nm de 39,2 × 103 M−1 cm−1)52 à l'aide d'un robot de cristallisation Mosquito LCP (TTP Labtech) dans des plaques suspendues à 20 °C. Les cristaux se sont développés dans la condition d'indice C5 (60 % Tacsimate pH 7,0) et ont été encore optimisés en augmentant la concentration de Tacsimate pH 7,0 à 70 %. Les cristaux ont été cryoprotégés en utilisant 100 % de Tacsimate pH 7,0. Les monocristaux ont été montés avec CrystalCap HT Cryoloops (Hampton Research) avant la congélation éclair dans l'azote liquide. Les données de diffraction initiales ont été recueillies en interne sur un Rigaku Raxis-IV++. Les phases initiales ont été déterminées en utilisant le remplacement moléculaire avec le code PDB 2B3P. Le raffinement et la construction du modèle ont été effectués à l'aide de Phenix57 et Coot58. Des données anormales ont été recueillies à l'aide d'une longueur d'onde de 1,378 Å à l'Advanced Photon Source sur la ligne de lumière 24-ID-C. Bien que la structure puisse être déterminée par phasage SAD à l'aide du programme Phenix AutoSol, le modèle construit à partir des données internes a été utilisé pour le remplacement moléculaire, suivi de la construction et du raffinement du modèle.

La vitrification a été réalisée à l'aide d'un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher) fonctionnant à 8°C et 100% d'humidité. Un total de 3,5 μL d'échantillon (8 mg/mL de MsbA chargé de cuivre soit apo soit piégé avec de l'ADP-vanadate dans du NaCl 200 mM, HEPES 20 mM pH 7,4, additionné de 2x CMC C10E5) a été appliqué sur des grilles de carbone trouées (Quantifoil 300 mesh Cu 1,2/1,3) déchargées pendant 30 s. Les échantillons contenaient un excès molaire double de KDL. Les grilles ont été buvardées pendant 5 s à la force de buvardage 1 en utilisant du papier filtre Vitrobot standard (Ted Pella, 47000-100), puis plongées dans de l'éthane liquide.

Les grilles optimisées ont été envoyées à l'Advanced Electron Microscopy Facility de l'Université de Chicago pour la collecte de données. L'ensemble de données a été collecté sous forme de piles de films avec un microscope électronique Titan Krios fonctionnant à 300 kV, équipé d'une caméra à détecteur direct K3. Les images ont été enregistrées à un grossissement nominal de 81 000x en mode de comptage super-résolution par décalage d'image. Le temps d'exposition total a été fixé à 4 s avec une image enregistrée toutes les 0,1 s, ce qui donne 40 images dans une seule pile avec une exposition totale d'environ 50 électrons/Å2. La plage de défocalisation a été fixée entre -1,0 et -2,5 μm. Voir le tableau supplémentaire 8 pour les détails des paramètres de collecte de données.

Les films collectés ont été soumis à une correction de mouvement par MotionCor259. Le traitement ultérieur a été effectué dans cryoSPARC60. Le flux de traitement de données détaillé est illustré à la Fig. 15 supplémentaire (MsbA piégé au vanadate) et à la Fig. 22 supplémentaire (MsbA ouvert, orienté vers l'intérieur). La dérive de scène et le mouvement anisotrope des images de la pile ont d'abord été corrigés par une correction de mouvement basée sur des patchs. Les paramètres CTF pour chaque micrographie ont été déterminés par une estimation CTF basée sur le patch. Pour le MsbA piégé au vanadate, les particules ont été sélectionnées à l'aide des modèles générés à partir du sélecteur de gouttes. Pour le MsbA ouvert et orienté vers l'intérieur, l'ensemble de particules final a été sélectionné à l'aide de modèles générés à partir d'un modèle 3D à partir d'une reconstruction antérieure. Pour les deux ensembles de données, les particules ont été nettoyées par deux cycles de classification 2D. Trois modèles initiaux ont été générés à partir des particules restantes en utilisant une reconstruction ab initio. Les particules ont ensuite été classées par raffinement hétérogène sur la base de trois modèles initiaux. Pour le MsbA piégé au vanadate, la meilleure classe de particules a été sélectionnée pour un raffinement non uniforme avec défocalisation par particule et optimisation CTF, et une symétrie C2 imposée, résultant en une carte finale résolue à 3, 6 Å. Pour le MsbA ouvert, la meilleure classe de particules a été sélectionnée pour un raffinement non uniforme avec une symétrie C2 ou C1 imposée, résultant en des cartes finales résolues à 3,88 Å et 4,06 Å, respectivement. Voir le tableau supplémentaire 8 pour les détails des statistiques de traitement d'image.

La structure17 précédemment rapportée de MsbA avec ADP-vanadate d'Escherichia coli (PDB 5TTP) a été ancrée dans la carte cryo-EM à l'aide de Chimera61. Le modèle a été affiné manuellement à l'aide de Coot58. Phenix57 a été utilisé pour générer les fichiers de coordonnées et de contraintes pour KDL. Le modèle final a subi plusieurs cycles de raffinement dans l'espace réel à l'aide de Phenix avec des contraintes de structure secondaire et de Ramachandran. Les valeurs aberrantes de la géométrie ont été corrigées manuellement dans Coot (après chaque tour). Les statistiques de la dernière phase de raffinement du modèle et la géométrie du modèle sont présentées dans le tableau supplémentaire 9. Les chiffres ont été générés à l'aide de ChimeraX62 et Pymol (Schrödinger LLC., version 2.1). Voir le tableau supplémentaire 9 pour les détails des statistiques du modèle.

Les séquences pour l'analyse de conservation ont été recueillies à l'aide de NCBI Blast et de la protéine MSBA d'E. coli comme entrée. Nous avons recherché séparément les séquences MSBA des gammaprotéobactéries, des deltaprotéobactéries, des alphaprotéobactéries, des epsilonprotéobactéries, du clade FCB et des bacilles pour obtenir une large représentation parmi les bactéries. Nous avons ensuite aligné les séquences avec Muscle 3.83. Nous avons supprimé toutes les lacunes causées par la séquence absente dans la séquence d'E. coli et extrait les sites en interface avec KDL à l'aide d'un script python personnalisé. Un sous-alignement contenant uniquement ces sites a été utilisé avec le serveur weblogo (https://weblogo.berkeley.edu/) pour générer le logo de la séquence. Pour l'analyse des séquences N-terminales des transporteurs ABC, plus de 20 k séquences MsbA ont été téléchargées à partir d'UniProt. Un script python utilisant BioPython63 a analysé des séquences contenant une séquence N-terminale de commencer par MH.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques et les facteurs de structure pour la structure cristalline d'un fragment N-terminal de MsbA fusionné à la GFP et lié au cuivre (II) ont été déposés dans la Protein Data Bank (PDB) sous le code d'accession 8DHY (copper(II)-bound MsbA N-terminal peptide fusioned to GFP). Les structures et les cartes MsbA cryoEM ont été déposées dans la PDB et l'EMDB comme suit : 8DMO (MsbA ouvert, orienté vers l'intérieur) et EMD-27545 (MsbA ouvert, orienté vers l'intérieur) ; et 8DMM (MsbA piégé au vanadate et lié au KDL) et EMD-27544 (MsbA piégé au vanadate et lié au KDL). Les structures protéiques précédemment rapportées utilisées dans cette étude sont : 5TTP (MsbA occlus, orienté vers l'extérieur) ; 6BPP (MsbA en complexe avec G092) ; 6BPL (MsbA en complexe avec G907 et LPS); 7BCW (MsbA piégée au vanadate); 6BL6 (Salmonella typhimurium MsbA ouvert, orienté vers l'intérieur); 3B60 (Salmonella typhimurium MsbA ouvert, orienté vers l'extérieur); et 2B3P (superdossier GFP). Les données MS natives ont été déposées chez Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7268757). Un fichier de données source est fourni avec cet article. D'autres données associées à ce manuscrit sont disponibles sur demande.

Le code Python pour déterminer les constantes de liaison d'équilibre individuelles est disponible sur https://github.com/LaganowskyLab.

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Nous remercions Bryan Tomlin du Laboratoire d'analyse élémentaire pour l'analyse élémentaire, Jonathan Schuermann et Igor Kourinov de l'APS pour une discussion utile concernant la collecte de données. Nous remercions également Lauren Stover pour son aide dans la préparation du liposome MsbA. Une partie de ce travail est basée sur des recherches menées sur les lignes de lumière de l'équipe d'accès collaboratif du nord-est (P30 GM124165) à l'Advanced Photon Source (DE-AC02-06CH11357). Ce travail a également été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) sous les numéros de subvention (DP2GM123486, R01GM121751, R01GM139876, R01GM138863 et RM1GM145416 à AL ; R35GM143052 à MZ ; et P41GM128577 à DR) et Max Planck Society à GKAH. Nous remercions le personnel de l'Université de Chicago Advanced Electron Microscopy (RRID:SCR_019198) pour l'aide à la collecte de données cryo-EM. Nous remercions le Research Computing Center de l'Université de Chicago pour le soutien de ce travail en mettant à disposition les ressources de calcul du cluster Beagle3 HPC financé par le NIH (S10OD028655).

Charles Packianathan

Adresse actuelle : Walter Reed Army Institute of Research, Pilot Bioproduction Facility, Silver Spring, 20910, MD, États-Unis

Département de chimie, Texas A&M University, College Station, 77843, TX, États-Unis

Jixing Lyu, Tianqi Zhang, Samantha Schrecke, Nicklaus P. Elam, Charles Packianathan, David Russell et Arthur Laganowsky

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Université de Chicago, Chicago, 60637, IL, États-Unis

Chang Liu et Minglei Zhao

Institut Max Planck de microbiologie terrestre et Département de chimie, Université de Marburg, Marburg, Allemagne

Georg KA Hochberg

Centre de microbiologie synthétique (SYNMIKRO), Département de chimie, Université de Marburg, Marburg, Allemagne

Georg KA Hochberg

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JL et AL ont conçu la recherche. JL, TZ, NE et CP ont exprimé et purifié MsbA. JL a effectué des expériences de spectrométrie de masse. JL et TZ ont réalisé les tests fonctionnels. JL, MZ, DR et AL ont analysé les données. CL et MZ ont collecté et traité des données cryo-EM. SS, JL, TZ et AL ont effectué une cristallographie aux rayons X. SS, CL, JL, MZ et AL ont construit les modèles atomiques. GH et AL ont analysé les séquences MsbA. JL et AL ont rédigé le manuscrit avec la contribution des autres auteurs.

Correspondance à Arthur Laganowsky.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Antonio Calabrese, Erik Yukl et l'autre relecteur anonyme pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

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Réimpressions et autorisations

Lyu, J., Liu, C., Zhang, T. et al. Base structurelle de la régulation des lipides et du cuivre du transporteur ABC MsbA. Nat Commun 13, 7291 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34905-2

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Reçu : 01 août 2022

Accepté : 10 novembre 2022

Publié: 26 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34905-2

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